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转基因的研究
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1984年首次利用农杆菌Ti质粒将外源基因导入烟草(Nicotiana tabacum)获得 。在随后的数年时间里，植物基因工程研究取得了突破性的进展，已在许多物种上获得了转基因植株。植物遗传转化技术在基础研究和应用研究中的价值得到了很大的体现，尤其在应用研究上植物遗传转化技术具有超越了种间隔离的优点，吸引了广大分子育种学家投入到这方面的研究中来。但转基因植物能否广泛应用，其关键在于所转基因能否在遗传转化体内稳定整合和表达。然而转基因的不同整合方式，不但影响外源基因在转基因植株中的表达性能，而且还有可能对宿主基因组中的固有基因的表达产生影响Fladung(1999)认为转基因植物中外源基因的表达稳定性取决于目的基因在宿主中的整合特性及其旁侧序列性质。 因此，尽可能了解外源基因的整合机制及如何影响其表达和遗传稳定性是必要的。不同的转基因植株的整合方式有较大区别, 不同的研究者所采用的研究策略亦有所区别。 宿主基因组的遗传学组成在转基因整合和表达中发挥着重要的作用。而且外源基因的插入位点的性质及旁侧序列均能影响外源基因的活性，即所谓的位置效应。Leeuwen等(2001)认为在不同转化体间外源基因的定量表达差异通常归因于转基因的不同整合位点。Meyer等(1992)和Walter等(1992) 都报道了转基因插入位点的旁侧DNA序列可以影响外源基因的表达水平。Iglesias等(1997)在烟草上的实验表明，稳定表达的转基因植株中外源基因常整合在宿主染色体的端粒附近与核基质结合，而不能稳定表达的转基因植株中外源基因常常整合到异染色质区和中间区域或高度重复序列。也有研究认为外源基因的沉默与整合位点的遗传学组成有关(Kumar and Fladung,2001 )。Hilder等(1989)认为外源基因的沉默多是由于插入位点附近染色体的微环境影响了外源基因的启动子的表达活性所致。另外，从遗传学角度看，如果外源基因整合在一个有高度转座活性的区域可能导致外源基因的丢失。 目前，有许多研究报道了外源基因在宿主中的整合与重排机制。针对于农杆菌介导的T-DNA整合机制主要可分为两类。在第一类整合机制中认为T-DNA5'端连接的VirD2蛋白起主要作用。在这种机制下T-DNA 两端的作用机制不同。T-DNA 的右边界和植物基因组的目的位点只有一个或没有碱基配对，然而T-DNA的左边界和预整合位点(pre-insertion site)间有较长的相似片段存在。T-DNA整合的发生是通过VirD2蛋白将T-DNA 5'端与基因组序列相连。然而一些研究表明，VirD2蛋白不能拥有连接酶的活性。与第一类不同，在第二类整合机制中不强调VirD2 蛋白的作用。只是由于T-DNA 的右边界与预整合位点的序列具有较高的同源性并且右边界被部分截短。有研究者认为这类整合机制通过双链断裂(double-strand breaks, DSB)修复机制完成(Salomon and Puchta,1998)。Kumar和Fladung(2002)研究转基因山杨的整合位点的结构和T-DNA的特点时综合了这两类机制提出了以基因组的双链断裂修复为基础的整合模型。这个模型可分为两个部分：(a) 经过修改的SDSA(synthesis-dependent strand-annealing)整合模型; (b) 通过SDSA(synthesis-dependent strand-annealing)途径产生的中途失败的缺口修复模型。其具体过程。由图1 可以看出在第二部分过程中由T-DNA的左边界复制形成的填充DNA 就插入到了T-DNA的右侧与基因组序列之间。这个模型可以很好地解释T-DNA的整合过程及填充DNA(filler DNA)的形成。但并不能很好地解释许多研究所报道的多拷贝单位点整合等复杂的整合方式，也不能解释DNA直接转化中的整合情况。Kohli等(1998)提出的两阶段整合机制，可以解释上述这些整合方式。这种机制认为外源基因的整合是分两个阶段进行的。第一阶段为预整合阶段，在这一阶段转化的质粒分子(完整的或不完整的)相互连接形成多联体。这一过程增加了外源基因重排的可能性。第二阶段为外源基因的整合阶段，在这一阶段中外源基因在宿主染色体中的整合开始。在这一过程中最初的整合位点被认为是“热点(hot spot)”，它促进了随后的整合外源基因分子整合在同一位点，并进一步形成了连续的多拷贝单位点整合。这一机制是由基因枪直接转化水稻的研究中得出的。但也有一些研究认为适合于解释农杆菌介导的TDNA转化的整合机制。 外源基因整合是一个相当复杂的问题。虽然有许多研究报道了不同的模型和机制，但这些模型只是根据某一物种或某一转化方法的研究提出的，还不能适合所有的整合情况，还有待于进一步系统地研究。 图1 T-DNA的整合模型 (a): ⅰ. 植物基因组DNA通过核酸外切酶产生单链3'突出端; ⅱ. 这个3'突出端与T-DNA的左边界中的 少数几个同源碱基配对并且开始缺口修复过程; ⅲ. 单链T-DNA为模板进行T-DNA的合成; ⅳ. 新合成 的序列的3'末端与另一部分的相似序列连接; ⅴ. 单链的缺口修复完成同时T-DNA的整合完成。(b): ⅰ. 植物基因组DNA通过核酸外切酶产生单链3'突出端; ⅱ. 图中下方的单链自由3'末端与T-DNA的左边 界末端的较短的相似序列配对并把T-DNA作为模板开始缺口的修复完成; ⅲ. 缺口的修复过程中途失败 停止，并且T-DNA 的左边界重新与上方的单链3' 末端结合(T-DNA 的左边界已经被复制连接于下方的 单链上——灰色哑铃形); ⅳ~ⅶ 的这些过程与第一部分中的ⅱ~ⅴ相同。 |
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