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19811015

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[交流] 眼部常见真菌的实验室诊断技术

北京同仁眼科中心北京市眼科研究所
罗时运李然王智群

感染性眼病是眼科的常见病和多发病。细菌常致眼组织不同程度的损害，有时后果严重，危害视力。在发展中国家，细菌性感染是致盲的第一位原因。细菌性感染的致病菌种类很多，对组织的损伤程度各异。随着环境的改变，卫生条件的改善，众多广谱抗生素在眼科的广泛应用，以及细菌本身生物学特性的变化，眼部感染的细菌菌谱也发生不断的变化，但其基本的鉴定方法是不变的。细菌属种鉴定主要依据固体培基上菌落形态特征、液体培基混浊情况、涂片染色镜检菌体形态及细菌代谢过程中所产生的分解与合成代谢产物不同（如对碳源、氮源的利用、酶类反应等试验）鉴定细菌种类。
目前实验室鉴定细菌常采用手工鉴定、快速细菌鉴定组合（如API系统等）或全自动、半自动微生物鉴定仪。

概述

　　真菌是一类有细胞壁，无叶绿素，以寄生或腐生方式生存，仅少数类群为单细胞，多数为多细胞，能进行有性或无性繁殖的一类真核细胞型微生物。
　　空气中腐生真菌孢子可污染结膜囊，暂时存留。因自然条件、季节、环境、职业等因素不同，正常结膜囊真菌阳性率为2 %~25 %。正常情况下不致眼病，但一定条件下如外伤、长期应用广谱抗生素、皮质激素、免疫抑制剂引起菌群失调，导致外源或内源性真菌侵入眼部致病。
　　近年镰刀菌、曲霉菌等真菌感染性眼病增多，在诊断、治疗方面都是需要重视的问题。

【真菌的生物学特性】
　　1．分类：
　　（1）单细胞真菌：如念珠菌属、酵母菌属等
　　（2）多细胞真菌：如丝状菌（霉菌）等
　　（3）双相型真菌：如申克孢子丝菌等
　　2．形态结构：
　　（1）真菌的营养体：菌丝
　　菌丝：由成熟的孢子在基质上萌发产出的芽管，进一步伸长，并产生分枝而不断生长形成的，或者是由一段菌丝细胞增长而形成单一的细丝称为菌丝。菌丝分为有隔菌丝和无隔菌丝。菌丝为透明管状，直径2~6μm。细胞壁由几丁质、纤维素、葡聚糖等构成，原生质内有典型核结构、内质网、线粒体等细胞器及肝糖等内含物。菌丝生长过程中在一定间距，形成分隔的为有隔菌丝，不形成分隔的为无隔菌丝。菌丝延长或分枝交织成网状或团状称菌丝体。菌落绒状或絮状，伸入寄生物、培养基内吸取水分、营养的菌丝为营养菌丝，向空气中伸展的菌丝为气生菌丝，由此产生孢子。(图1-1、2、3、4)
　　　　　　　　　　　　　　
　　（2）真菌的繁殖体：
　　①子实体：产生孢子的组织体
　　②孢子：无性孢子和有性孢子
　　真菌通过无性、有性或菌丝断裂繁殖。孢子是真菌繁殖的一种重要方式，脱落后在空气中播散，易被携带且抵抗力较强，在适宜环境下萌发芽管，延长为菌丝而继续繁衍。酵母型、类酵母型单细胞真菌为圆或卵圆形，直径3 ~ 6 μm，发芽增殖。幼芽成熟后自母细胞脱落，如子细胞延长不脱落，继续发芽成细胞链称假菌丝。
　　3．繁殖方式：
　　真菌的繁殖方式有两种，即有性繁殖和无性繁殖。

【真菌的检查方法】
　　1. 不染色法：10%~20%氢氧化钾湿片法
　　（1）原理：利用氢氧化钾溶解刮片中的非真菌杂质而显示菌丝。
　　（2）检查方法：将刮取的角膜组织或活检组织，放在清洁的载玻片上，滴加10%~20%氢氧化钾1~2滴，覆以盖玻片。在弱火焰上微微加温，使杂质溶化清晰，先用低倍镜找到标本位置，再用高倍镜或油镜观察菌丝和孢子。（图1-5）若同时加入亮绿或甲基绿能增加对比度。
　　（3）结果分析：该法实用、简单快速，能在镜下见到不同种菌丝形态，有的能见到孢子。缺点为易出现假阳性或假阴性。
　　2．染色法：
　　（1）姬姆萨（Giemsa）染色：
　　　　染液为Giemsa染液，临用前原液与工作液1:20混合，制备成应用液。
　　①检查方法：刮片方法见第一章，甲醇固定。
　　②染色：Giemsa工作液染20分钟，倾去，水洗、待检。
　　③结果分析：丝状真菌、类酵母菌染为紫或红色，核蓝紫色、紫红色，胞壁、中隔及死亡菌丝不着染，背景为粉红或淡蓝色（图1-6）。

　　　　　　　　　　
　　（2） Gram染色
　　①检查方法：刮片方法同上。
　　②染液和染色步骤：见第一章。
　　③结果分析：丝状真菌因菌龄不同，其内容物不同，着染为紫蓝色、红色，细胞壁及中隔不着染，衰老或死亡菌丝呈玻璃样。念珠菌等芽生细胞及假菌丝染为紫兰色（图1-7）。
　　（3）荧光染色法
　　所用荧光染料有吖叮橙和钙荧光白（Calcofluor white CFW）。CFW是一种二苯乙烯类的荧光增白剂，能与真菌细胞壁的纤维及几丁质发生特异性的结合，荧光显微镜下可快速检出真菌，尤其是真菌生长旺盛部位如菌丝顶端，酵母芽孢等。荧光显微镜下丝状真菌细胞壁呈亮绿色，核绿色。类酵母菌、假菌丝、厚膜孢子呈红橙色。
　　（4）过碘酸雪夫氏（periodic acid—schiff，PAS）染色丝状真菌、类酵母菌染为红色（图1-8）。
　　（5）果莫里六胺银（Gomori`s methenamine silver，GMS）染色法
　　用铬酸氧化真菌多糖为醛，还原六亚甲基四胺银成为可见的金属银。丝状真菌细胞壁及中隔染为黑色，酵母、类酵母菌染为黑色。背景淡绿色，对比明显，显微镜低倍镜下即可见。
　　PAS 和 GMS这两种染色法不但在病理切片中显示真菌效果卓越，且许多作者认为在角膜刮片中显示真菌具有特异性高、易辨认之优点。缺点是需特殊化学试剂及费时较长。

　　　　　　　　　　　　　　

【真菌培养及鉴定】
　　（1）操作方法
　　①常用培养基：土豆葡萄糖培养基(首选)、沙氏培养基、察氏培养基。
　　②培养温度：25~28℃，湿度40%~50%。
　　③时间：3~10天。
　　④结果分析：根据真菌生长速度，菌落外观、菌丝、孢子或菌细胞形态特征等进行鉴别。
　　（2）鉴定方法
　　①湿片法：
　　采用乳酸酚棉蓝染液制成临时性的湿片标本，观察形态或测量其大小。
　　方法：
　　1)将洁净的载片中央滴一滴乳酸酚棉蓝染液。
　　2)用接种针从培养皿或试管的菌落上，挑取少许菌体，置载片的液滴中，并将菌丝体挑开，勿使成团。
　　3)加盖玻片即得到临时性湿片标本。
　　在观察时注意以下各项特征：
　　a 菌丝：气生菌丝和底部菌丝的宽度，有无横隔，色泽，特殊的菌丝器官（假根、足细胞、结节或隆起等），有无菌丝素，有无锁状联合等。
　　b 子实体的形态：成熟后子实体如孢子囊、子囊壳、子囊、担子果等等的颜色，形状，大小，结构等。
　　c 孢子：无性孢子如包囊孢子、分生孢子、芽孢子、节孢子、厚垣孢子等；有性孢子为卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担孢子等。它们的形状，颜色，表面的特征（如纹饰或突起等），孢子有无分隔（由单细胞还是多细胞构成），孢子萌发的类型（单极出芽、两极出芽或多极出芽等）。
　　附：乳酸酚棉蓝染液配置方法：结晶酚20g、乳酸20ml、甘油40ml、蒸馏水20ml，混合后隔水加热并充分搅拌直至完全溶解。然后加入棉蓝0.05g，混合均匀，必要时可过滤，瓶装备用。
　　②小培养法
　　1）方块法：
　　取无菌平皿倒入约15ml溶化的培养基，待凝固后以无菌小铲或接种刀划成1×1×0.5cm大小的小块,移在无菌载玻片上，然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株，盖上消毒的盖玻片。放入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，滤纸以无菌蒸馏水湿润，也可用无菌蒸馏水浸湿的棉球代替，置温箱培养。平皿必须保持湿润，需要时可加水。待菌落生长后，取出载玻片直接置显微镜下观察，也可待菌落充分生长后，揭下盖玻片，反面朝上，加95%酒精脱水，干后滴PVA乳酸酚棉蓝液封固，可长久保存。载玻片上的琼脂块移去后，若玻片上也有菌落生长，也可以同样的方法观察、制片保存。（图1-9）
　　2）钢圈法：
　　取直径约2cm、厚度约0.5cm有孔口的不锈钢小钢圈，将其在酒精灯火焰上烧热后蘸蜡趁热粘在无菌载玻片上，用灭菌滴管吸取或直接倒取事先溶化好的培养基，培养基量约占小钢圈容量的1/2，并形成一个小斜面，注意避免气泡。待培养基凝固后取一消毒盖玻片，火焰加热后，趁热盖在小钢圈表面。最后用接种针将待鉴定菌种通过通气孔接种在培养基的边缘（尽可能靠近盖片）。其余注意事项同小方块法。这种方法的优点是形成一种封闭式培养，不易被污染。（图1-10）
　　　　　　　　
【组织病理检查】
　　怀疑真菌性角膜炎而角膜刮片阴性者，可作角膜活检。用尖刀片切取角膜病损组织，或在穿透性角膜移植术时钻取病损组织，用10%甲醛或95%酒精固定，石蜡包埋，切片，染色（HE染色、PAS染色或吖叮橙染色等）。或用2.5%戊二醛固定，做电镜切片，观察真菌的超微结构。
　　引起眼部感染的常见放线菌主要有链霉菌、奴卡氏菌等，多引起角膜炎、泪小管炎、泪囊炎、结膜炎等。
　　（1）链霉菌（streptothrix）为纤细的分枝与不分枝的长菌丝，常断裂为杆菌与细小球菌，革兰氏染色着染不同，杆菌阴性，球菌阳性。Giemsa 染色能更清楚地识别其形态。泪小管分泌物呈白、灰黄色凝块，压片染色镜检见菌块与菌体（图1-14）。培养生长较慢。常致下泪小管炎，并发慢性结膜炎、泪囊炎。
　　（2）奴卡氏菌（Nocardia）是一群需氧性放线菌，广泛分布于土壤中。多数为腐生的非致病菌，其中对人类有致病作用的有星形奴卡氏菌和巴西奴卡氏菌。本属为丝状，易断裂为杆菌与细小球菌（图1-15）。抗酸染色呈弱阳性反应，在普通培养基上菌落大小不等，表面有皱褶或呈颗粒状。不同种可产生不同色素，如黄色、橙红、红色以及其它颜色。眼部常引起角膜炎、泪囊炎、泪小管炎、结膜炎、眼内炎等。　　　　　　　　

真菌的药物敏感实验

　　1．纸片法：

　　（1）培养基：沙氏葡萄糖琼脂培养基
　　（2）药敏纸片：新华1号滤纸，直径6mm，充分浸泡不同浓度和种类的药液，干燥。
　　（3）待测菌液的配制：

　　①酵母菌：沙氏琼脂培养基上培养24~48小时后的菌落，用蒸馏水或生理盐水将菌落洗下，制成混悬液，浓度约为（0.5~2.5）×103CFU/ml，备用。
　　②丝状菌：培养7~10天生长旺盛的菌落，用蒸馏水或生理盐水将菌落洗下，以无菌玻璃珠研细，制成混悬液，浓度约为10×103CFU/ml，备用。

　　（4）方法：将菌液均匀涂布于沙氏培养基上，贴药敏纸片，28℃培养。
　　（5）结果：48~72小时，观察抑菌圈的大小。

　　2．酵母样真菌的微量稀释法

　　根据美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）1992年提出的酵母菌液体培养基稀释法，抗真菌药敏试验参考方案(M27-P)及改良后的微量平板液体稀释法而设计。

　　（1）材料：无菌96孔（u形）微量稀释板
　　（2）培养基：

　　① RPMI 1640液体培养基
　　② YNB液体培养基
　　③ M3肉汤培养基

　　（3）待测菌液的配制：沙氏琼脂培养基上培养24~48小时后的菌落，用蒸馏水或生理盐水将菌落洗下，制成混悬液，浓度约为（0.5~2.5）×103CFU/ml，备用。
　　（4）药液的配制：不同的药液浓度有所不同，根据抗真菌药物的具体情况选择浓度。采用倍比稀释法稀释药液，同时做药物稀释液对照，培养基对照，标准菌株对照。
　　（5）结果：按照酵母菌被完全抑制时的药物浓度定其MIC。

　　3．NCCLS于1998年提出了《产孢丝状真菌的液体培养基稀释抗真菌药敏试验参考方案》（M38—P）。现将该方法简介如下：

　　（1）被检测真菌　本方案主要用于眼科常见的镰刀霉、曲霉等产孢丝状真菌。
　　（2）抗真菌药物

　　测试用药物包括眼科常用的氟康唑（FCZ），伊曲康唑（ICZ），那他霉素（NTC），特比耐芬（TBF）酮康唑（KCZ），二性霉素B（AMB）和5—氟胞嘧啶（5—FC）。其来源均为直接购自药厂的标准粉剂，禁用药房及其他临床制剂。

　　（3）产孢丝状真菌的微量稀释法

　　培养基　　建议用RPMI—1640液基，称取10.35gMOPS（三氮吗啡丙磺酸），3.12gRPMI—1640，加280ml蒸馏水溶解后用1M NaOH调整PH至7.0，定容至300ml，滤过灭菌，4℃备用。

　　（4）实验过程与方法
　　药物稀释液的制备：
　　用RPMI—1640培养基将四种药物倍比稀释后依次加入96孔（12×8）板，每孔100μl，第一孔的浓度AMB、ICZ、TBF 为16μg/ml， NTC为64μg/ml。

　　真菌接种液的制备：
　　受试菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上28℃培养3-5天，用无菌生理盐水制备菌悬液，用血球计数板调整菌悬液的浓度为（20~250）×104/ml，然后加0.1ml至96孔药板的1~11列孔中，第11列为生长对照，第12列为阴性对照，28℃孵育46小时后读结果。

　　结果判定：MIC值为肉眼直接观察到的真菌生长完全被抑制的抗真菌药物浓度。

引起眼部感染的常见真菌的种类

　　引起眼部感染的常见真菌种类有镰刀菌属、曲霉属、青霉属、拟青霉属、链格霉属、枝孢霉属、短梗霉属、头孢霉属、无孢群、弯孢霉属、单端孢属、毛霉属、酵母菌等。

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