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[交流]
【求助/交流】肠道微生物总DNA的提取已有1人参与
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| 请问提取肠道内容物微生物DNA一般有哪些粉碎方法？我用的是玻璃球（直径3mm），涡旋3min，但是最终什么也没提出来，不知跟这个有没有关系 |
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2楼2010-04-13 17:46:29
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下面是我以前用过的一些混合菌群DNA提取方法，希望对你有所帮助：） 2.1.1 液氮研磨-SDS抽提法(Jan Dirk van Elsas et al, 2000) 称取2g风干样品，加入液氮研磨5min，然后加入1ml脱脂牛奶（0.1g脱脂奶粉＋25ml水），室温混匀后，5000rpm短暂离心去沉淀。加入4mlSDS抽提液（0.3% SDS in 140 mM NaCl, 50 mM NaAc, pH 5.1），于振荡器上振荡混匀。12100g离心10min，上清以等体积氯仿－异戊醇（v/v，24：1）抽提一次，12000g离心10min。集上清，加氯化钠至0.5M后，加0.6体积的异丙醇沉淀1小时后14000g离心15min。弃上清，70%酒精洗，12000g离心10min，弃上清，风干，加入60μl TE 溶解DNA。 2.1.2 珠击-酶解-SDS裂解-冻融法（Schabereiter-Gurtner et al, 2001） 称取2g风干样品，加入5ml DNA 抽提缓冲液Ⅰ（150 mM EDTA, 225 mM NaCl; pH 8.5），再加入3g 玻璃珠（φ=0.5mm），然后加入0.075g 溶菌酶，混匀，37℃培养30min。加入150μl 25%SDS和150μl蛋白酶K（20mg/ml）。于振荡器上剧烈振荡10min，然后37℃培养60min。加入2.5ml 90℃预热的DNA抽提液Ⅱ（100 mM EDTA, 400 mM Tris–HCl, 400 mM 磷酸钠缓冲液，pH 8.0 , 5.55 M NaCl, 4% CTAB ; pH 8.0）和1.8ml 25%SDS，于振荡器上剧烈振荡3min。三次冻融循环：-80℃ 液氮 10min，65℃ 水浴 10min。5000rpm离心10min，每700μl上清液中加入125μL 8M乙酸钾，手动混合1min，13000g离心10min。在上清中加入等体积氯仿-异戊醇（v/v，24:1）抽提，混匀后，12000g离心10min。取上清加入0.6体积的异丙醇室温沉淀一小时后14000g离心15min。弃上清，70%酒精洗，12000g离心10min，弃上清，风干，加入60μl TE 溶解DNA。 2.1.3 试剂盒法－3S DNA Isolation Kit for Environmental Samples V2.1 0.1g 风干粉碎样品置于1.5ml离心管中，加入200μl Solution SUS，将样品悬浮。加入400μl Solution LYS,上下颠倒混匀，静置30min。12000g离心5min，转上清至1.5ml离心管，加入120μl Solution BID，上下颠倒混匀。将溶液用1ml TIP 全部转移到3S柱内，柱子放入2ml收集管中，不盖管盖，静置2min。盖上管盖，12000g 离心1min。弃废液，柱子放回离心管，加入600μl洗液，1000g离心1min；重复此步骤一次。弃废液，柱子放回，10000g 2min，除去残留洗液。柱中加入100μl TE，放入新的1.5ml离心管，静置2min。12000g离心1min，收集液体为基因组DNA。 2.1.4 酶解和SDS裂解液化学法联合处理法 称取5g湿样， 加入5ml 100mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH=8.0），于振荡器上室温振荡5min。加入溶菌酶25mg，使最终浓度为2.5mg/ml，室温振荡15min，4℃放置30min。加入0.6ml 20% SDS，室温放置15min。然后2000g离心3min，转上清。在每650μl上清液中加入等体积酚抽提，12000g离心15min。上清转管，加等体积氯仿-异戊醇抽提两次，12000g离心15min。加入0.6倍体积的异丙醇，静置沉淀1小时。12000g离心15min，沉淀以70%乙醇洗，12000g离心10min，弃上清，风干，加TE悬浮DNA。 2.1.5珠击机械破碎结合酶解和SDS裂解液化学法联合处理法 称取0.3g风干样品，加入0.5ml 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH=8），再加入0.6g玻璃珠（φ=0.1mm），然后加入2.5mg 溶菌酶，于振荡器上室温振荡5min。加入0.25ml裂解液（0.1M NaCl, 0.5M Tris-HCl, pH 8, 10% SDS），于振荡器上室温振荡5-10min。12000g离心3min后集上清。加入等体积氯仿-异戊醇（v/v，24:1）抽提，混匀后，12000g离心10min。取上清加入0.4体积 7.5M 乙酸铵，冰上培养10min。12000g离心3min，集上清。加入0.6体积异丙醇，室温沉淀1小时后14000g离心15min。弃上清，70%酒精洗，12000g离心10min，弃上清，风干，加入60μL TE 溶解DNA。 |
3楼2010-04-13 17:47:12