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jdt5155873银虫 (正式写手)
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分子标记辅助选择 (MAS) 的发展策略
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分子标记辅助选择 (MAS) 的发展策略 在表型选择有效的情况下，MAS 更适用于隐性，限性，测定困难或费用昂贵以及未成熟期鉴定性状。在实际运用过程中应用一定策略，降低应用成本，MAS 的作用将可得到更大发挥。 1.1 定位作图与育种同步进行 育种群体与定位群体之间的重组频率是有变化的，不一定相同，在不同群体中 QTL 检测一致性低，而在同一群体不同世代中较高 (Bohn et al.，2001)。研究者对目标基因进行定位是为了利用这些基因，一个重要途径就是进行 MAS 提高种育种效率，为大规模培育优良品系或品种创造条件，而 MAS 希望使用在育种群体中与目的基因重组率仍旧较低的标记。方宣钧 等(2001)建议选择杂交亲本时尽量使用与育种直接有关的材料，所构建群体应尽可能做到既是遗传研究群体，又是育种群体，这样定位与 MAS 同步进行可缩短基因 (QTL) 定位研究与育种应用的距离，提高育种效率和 MAS 效益。 1.2 选择合适标记类型 适合于 MAS 的分子标记必须符合如下几个条件：检测手段简单快捷，易于实现自动化；DNA 质量要求不高，用量少，可以同时分析大量样品；信息量大，分析效率高；多态性好，在基因组中大量存在而且分布均匀；开发成本和使用成本低。目前已经发展出十几种标记技术，比较常用有 RFLP、RAPD、SSR、AFLP (amplified fragment length polymorphism)、SCAR、STS 和 CAPS 等。 理想分子标记应该是建立在 PCR 技术基础上，重复性高，在广泛基因背景下都能表达，在不同研究者中能相互交换使用，并能有效跟踪目标基因的标记，如水稻抗白叶枯病基因 Xa21 标记 pTA248。而选用何种分子标记来进行 MAS 选择，直接关系到选择效果。对于前景(目标基因)选择，所有标记技术都可以采用，但 PCR 标记最佳，共显性 SSR、CAPS 和 STS 是首选标记，其次是 SCAR。至于背景选择，应根据情况灵活选用，目前在低世代最合适的是 RAPD、AFLP 和 SSR 等，但在高世代 AFLP 由于可检测到更多多态位点而优于其他标记。 夏军红 等(2000)比较 AFLP 和 SSR 两种标记背景选择的相关性，发现达显著水平，结果具有同一性。因此，在实际应用过程中，选用一种标记类型进行背景选择即可。 1.3 DNA 提取的简化 1)半粒种子提取供试 DNA。将谷物类种子切分成两部分，带胚一半用于发芽播种，另一半胚乳用含蛋白酶 K 提取反应液，50℃～55 ℃ 温浴1小时，快速离心，100 ℃ 处理5分钟，离心后的上清液含有 DNA，可用作 PCR 分析。每次提取的 DNA 可进行25～50次 STS 反应和250～1000次 RAPD 反应。与叶片 DNA 结果一致，这种方法可进行早代选择 (Chunwongse et al.，1993；翟文学 等，1996)。2)碱法抽提 DNA。王春明 等(2003)从播种1～2周后水稻幼苗上取1～3 cm 长叶片放入备有适量0.4 mol•L-1 NaOH 的离心管中，用塑料棒碾磨至液体呈绿色，加160 μL Tris (100 mmol•L-1，PH7.5) 充分混匀，以稀释60倍后的上清液(浓度约5 ng•mL-1)作为模板 DNA (可置20 ℃ 保存)，取2 mL 至 PCR 板中进行 CAPS 分析(反应体系为20 mL)。原有的 DNA 大量提取法1个人平均1天能提取6～8个样品，而这些简便、快速 DNA 提取方法材料用量小，程序简单，化学试剂数量及用量少，DNA 质量高、数量多，每天均可以提取200个样品，完全可满足 MAS 育种需要。更简单的方法是利用成熟花粉粒制成悬液(经旋涡振荡和高温物理作用)后，可作为一种快速、简便、廉价的基因组 DNA 模板液直接用于 PCR 扩增(朱苏文 等，2002)。 1.4 快速 PCR 检测手段和体系优化 建立快速的 PCR 检测技术，检测显性 SCAR 标记时，可将琼脂糖凝胶电泳检测步骤省去，直接在 PCR 反应管中加入 EB 染色，在紫外灯下观测扩增产物的有无或者测定 PCR 产物浓度，鉴定是否有大量 DNA 存在，从而确定样品中是否含有目标基因(王新望 等，2000)。改造染色系统，利用甲烯蓝染琼脂糖凝胶，可直接在可见光下检测产物的有无。 减少 PCR 反应体积，可从20 μL 减少到15甚至10 mL，可大大地降低费用。当同时筛选到2个或以上的分子标记与目标性状连锁时，扩增产物具有不同长度但引物复性温度相匹配则可以在同一 PCR 条件下同时反应，这种多重 PCR 法的应用可显著地降低选择成本和筛选时间(王孝宣 等，2003)。 1.5 背景选择逐步选择法 段红梅 等(2003)对大豆 MAS 效果分析表明，用20条 SSR 引物与全部51条引物选出各株系的遗传背景回复率数值不同，排序也有差别，但是选择到相同株系比例较高。同时比较不同引物数目(10，20，30，40)与全部51条引物遗传背景回复率的相关性，相关系数分别为0.7520、0.8651、0.9344和0.9726，随着引物增加，相关程度也在增加，用40条引物几乎可得到51条的相同选择效果。夏军红 等(2000)对玉米染色体遗传背景回复率与基因组回复率的偏相关分析研究表明，绝大多数染色体与基因组遗传背景回复率的偏相关达显著水平，据此认为对有限数目染色体(一条或多条)进行背景选择可以达到对整个基因组选择类似结果。因此在背景选择中，当初始群体较大时，可以根据少数引物淘汰部分不符合选择要求的材料，再对遗传背景回复率较高的剩余材料增加标记进行进一步精确分析，在下一个世代对已恢复为轮回亲本的位点可不再选择。采用这种逐步选择方式，最终仍可选到最佳株系，这样可大大减少工作量，提高选择效率。 1.6 确定适宜的标记数量 使用3个分子标记的 MAS (Xa23) 符合率并不比使用2个有显著提高(潘海军 等，2003)，在实际应用中，选择2个位于基因两侧最近分子标记，这样不仅可以提高准确率，而且可以增加中选个体与受体亲本遗传背景同质性。Hospital 等(1997a)认为对每一个 QTL 最好用3个相邻的连锁标记进行跟踪选择，其中一个靠近目标 QTL，另两个近乎对称处在两侧。每条染色体(200 cM )或每一连锁群上2～4个标记用于背景选择，可得到理想选择结果(段红梅 等，2003)。选用标记时，首先应筛选出效应显著标记，当标记达到限度后，用低密度标记可降低成本减轻工作量，而不影响效率 (Moreau et al.，1998)。 1.7 数量性状标记辅助选择的方法 根据选择依据不同，数量性状标记辅助选择方法可分为基因型选择和基因型值选择阿种。吴为人 等(2002)用计算机模拟方法，对两种选择方法的潜力进行了比较，结果显示，两种方法的基本规律相似，除了在 QTL 数目很多又效应相等的情况下基因型选择表现较优之外，在其他情况下，两种方法的效果差不多。相对来说，基因型选择方法可以避免非加性效应和环境效应影响，因此具有优越性,但从应用角度看，基因型选择与基因型值选择相结合应是今后的发展方向。 1.8 确定合适选择方案 对于一些虽受主效基因控制，但可能还受—些背景基因影响的性状，只要供体亲本本身综合性状优良，就没有必要多次回交。可根据育种目标不同而进行1～2次回交或不回交，既可节约成本，提高育种成效，又可防止导入的基因丢失(罗彦长 等，2003)。在群体不够大，QTL 定位水够准确，每次至多导入4个 QTL，并且分步骤聚集 QTL 的回交育种方案比同时导入若干 QTL 更有效 (Hospital et al.，1997b)。用无重复的多点田间试验比一点重复试验易控制基因型与环境的互作并获得较大的遗传方差，并且可以检测出有利和不利 QTLs，提高 MAS 的效率，降低成本 (Ho et al.，2002)。 Ribaut 和 Betran (1999)提出 QTL 辅助选择的 SLS (single large scale) MAS 方法，即要求 QTLs 最好不超过3个，而且这些 QTLs 在不同的遗传背景及环境表达下稳定，占的表型变异为最大。Ho 等(2002)提出了 AB-QTL (advanced backcross QTL) 的选择方案，该方案可以打破 QTLs 间上位性作用，微效的加性和显性 QTLs 易检测出来，该方法将 QTL 的鉴定延迟了2～3代才进行，但可以大大缩短从 QTL 发现到品种培育的时间、从 QTL 的发现到测试 QTL-NIL 系仅需1～2年。Xie 和 Hu (1998)提出多性状同时 MAS 改良方法能聚集数量性状育种值，它的育种效果比常规方法选择或单个性状改良更好。因此找们可以根据育种的需要来确定合适的选择方案。 展望 尽管分子标记辅助选择 (MAS) 的背景选择效率很高，但在育种实践中，应将育种家的丰富选择经验和标记辅助选择相结合，依据个体表型进行背景选择的传统方法仍不应抛弃。而 MAS 普及的限制因素是成本与效益，因此应降低 MAS 的分析成本，提高分析鉴定技术，建立简单规范的操作体系。可以相信，随着分子生物学研究的新成果及其发展的新技术不断出现以及基因组学、生物信息学等研究的深入，和生物技术工作者与育种家围绕育种目标的真正结合，MAS 将会为作物育种作出更大贡献，使作物育种工作发生革命性变化。 |
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