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【原创】微生物常用的基本操作技术
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常用的基本操作技术 （一）消毒和灭菌技术 消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。消毒一般是指利用物理或化学方法消灭病原菌或有害微生物的营养体，而灭菌则是指利用强烈的物理或化学方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。但日常生活中两者常常通用。灭菌的方法很多，一般可分为物理灭菌和化学灭菌两大类。 1. 物理灭菌 物理灭菌是最常用的灭菌方法。主要包括热力学灭菌、过滤除菌和紫外线灭菌等。 （1）热力学灭菌 又可分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。 ①干热灭菌 干热灭菌是利用高温使微生物的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快；含水量越小，凝固减慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度更高（160~170℃），时间更长（1~2h）。进行干热灭菌时最高温度不能超过180℃，否则，包扎器皿的纸或棉塞就会被烤焦，甚至引起燃烧。通常所说的干热灭菌是指利用干燥箱（或称烘箱）进行灭菌，主要用于玻璃器皿如培养皿、移液管和接种工具等的灭菌。灭菌时将被灭菌的物体用双层报纸包好或装入特制的灭菌筒内，装入箱中，不要摆的太挤，以免妨碍热空气流通。逐渐加温，使温度上升至160～170℃后保持2h。灭菌结束后，切断电源，自然降温，待箱内温度降至70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。注意在温度降至70℃以前切勿打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。 另外，灼烧灭菌也属于干热灭菌。在进行无菌操作时，接种工具如接种环、接种钩、接种铲、镊子等要在酒精灯火焰上充分灼烧，试管口、菌种瓶口在火焰上作短暂灼烧灭菌等。 ②湿热灭菌 a.高压蒸汽灭菌 此法是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸汽有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用0.11MPa，121℃，20～30min可达到彻底灭菌的目的。 这种灭菌适用于培养基、工作服、橡胶制品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 b.常压蒸汽灭菌法 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。对于不易用高压灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，也可用普通蒸汽笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。 常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热100℃，30min，连续3d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18~24h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。 c.煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10～15min，可以杀死细菌所有营养体和部分芽孢。如延长煮沸时间，并加入1%碳酸氢钠或2%～5%石炭酸，效果更好。人用注射器和手术器械均采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌，或采用一次性无菌用品。 d.超高温杀菌 超高温杀菌(ultra high temperature sterilization，简称UHTS)是指在温度和时间标准分别为130～150℃和2～8s的条件下对牛乳或其他液态食品(如果汁及果汁饮料、豆乳、茶、酒及矿泉水等)进行处理的一种工艺，其最大优点是既能杀死产品中的微生物，又能较好地保持食品品质与营养价值。超高温杀菌工艺地应用，使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理想变成了现实。从而打破了地域和季节地限制。 超高温杀菌是自80年代以来已在世界各国广泛应用。我国改革开放以来，超高温杀菌也广泛应用于橘子汁、猕猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生产。 2.化学灭菌 化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等，只是阻抑细菌代谢机能；细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低，处理微生物的时间长短，微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。 微生物实验室中常用的化学药品有2%煤酚皂溶液（来苏尔），0.25%新洁尔灭，0.1%升汞，3%~5%的甲醛溶液，75%乙醇溶液等。常用化学杀菌剂的配制见附录四。 消毒与灭菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。 （二）无菌操作技术 在微生物的分离和培养过程中，必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作技术，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器或系统内，避免污染培养物。无菌操作技术广泛应用于微生物、组织培养及基因工程等领域。 无菌操作技术，简单的说就是在无菌环境中进行的操作，为保证获得纯净的培养物，需要考虑各种因素的影响。无菌操作过程各个环节见下图： （1）培养基灭菌 一般采用高压灭菌，将培养基放在高压锅中，排净冷空气后，在121℃灭菌20～30min，保证培养基处于无菌状态。 （2）创造无菌接种环境 无菌操作必须在无菌条件下进行。常见的无菌场所有净化工作台、接种箱和接种室。在进行操作前需将灭菌后的培养基以及接种用的酒精灯、工具等，放到接种场所，然后采用物理或化学方法进行环境处理。 ①净化工作台 操作前用75％的酒精棉球擦拭台面，然后打开紫外线灯照射消毒，并打开风机吹20～30min，将台面上含有杂菌的空气排除，保持台面处于无菌状态。 ②接种箱 操作前按照每m3空间用10～14ml甲醛和5～10g高锰酸钾进行混合熏蒸，熏蒸时间不少于30min。或用市售气雾消毒剂进行熏蒸，每m3空间用4～5g。接种箱中如有紫外线灯时，同时打开。 ③接种室 灭菌方法同接种箱。为避免药害，接种前可以喷洒甲醛用量1/2的氨水来中和残留的甲醛。 （3）手消毒 先用肥皂水洗手，再用75％的酒精棉球擦拭手表面。 （4）工具灭菌 点燃酒精灯，将接种工具在酒精灯外焰上充分灼烧，杀死工具表面附着的杂菌。工具灭菌后不得再接触台面。 （5）无菌操作（以转管为例） 左手拿一支母种和一支空白PDA培养基，右手拿灭菌后的接种构，将两个棉塞同时拔掉，夹在右手的无名指和小拇指、小拇指和掌根之间，不可将棉塞放到台面上。拔掉棉塞后，试管口要在酒精灯火焰上方3～5cm处，利用火焰封口，然后用接种构切取少量母种，迅速通过酒精灯火焰，放到空白培养基斜面中央，轻压以防止滑动。最后塞好棉塞。 （6）培养 将接种后的菌种放到适宜的环境条件下培养。培养环境要注意消毒，防止培养过程中杂菌侵染菌种。 （7）检查 培养过程中要经常检查菌丝生长情况，发现有杂菌污染的菌种要及时挑出。 在进行微生物分离纯化以及其它无菌操作时，要有责任心，培养自己的无菌意识，加强训练，提高熟练程度，降低污染率。 |
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