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[交流] 抗生素无菌检查方法验证

头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证
1. 样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶；批号：40807001；生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH
2. 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面(均由中国药品生物制品检定所培养基室提供)；营养琼脂、虎红琼脂 (另由本室自行配制) 。
3.β-内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号：20030630）
4. 验证试验用菌种：(1) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]； (2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]； (3) 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102]； (4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104]；（5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]；(6) 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]； (7) 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。
5. 仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
6 方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验。
7. 操作方法
7.1 菌液制备：
取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
取经32.5±2.5℃培养19~21h小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。
取经36℃培养18~22h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，混匀备用。
白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中[见附录1.3], 25.5±2.5℃培养24～48小时。
取经25.5±2.5℃培养72小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理盐水9ml，混匀备用。
将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5±2.5℃培养5～7d，使大量的孢子成熟。取经25℃培养7d的黑曲霉真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，稀释至10-4，取0.5ml加生理盐水10ml混匀备用。
7.2 菌液计数：分别取上述5种细菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养琼脂约18ml。30~35℃培养（生孢梭菌置厌氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入虎红琼脂约18ml。23~28℃培养。
7.3 供试液制备：每2支以100ml生理盐水溶解，混匀备用。
8. 薄膜过滤：将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌少于100CFU。按规定将培养基直接加至滤筒内。每天观察并记录结果。
8.1 阳性对照：另取滤筒，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照，将含培养基的容器按规定温度培养3～5天。各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。取未加样品的滤器分别加硫乙醇酸盐流体培养基5桶及真菌培养基2桶，100ml/桶。
8.2 阴性对照：两个滤器桶内各过滤生理盐水200ml，然后分别加入硫乙醇酸盐培养基和真菌培养基各100ml，不加对照菌液，分别于30-35℃及23-28℃培养。
9. 培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
10. 结果
10.1细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1    细菌数计数
菌种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌生孢梭菌
计数(CFU) 22 26 36 39 62 66 58 54 20 20
均值(CFU) 24 38 64 56 20

表2 真菌数计数结果
菌种黑曲霉菌白色念珠菌
计数(CFU) 86 93 86 83
均值(CFU) 89 85

10.2实验结果见表3和表4。

表3 细菌实验结果 (20小时观察)
大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌生孢梭菌
冲洗量800ml 72h( - ) + + + +
冲洗量1000ml      + + + +
阳性对照 + + + + +
表4    36小时观察真菌结果
黑曲霉菌白色念珠菌
冲洗量200ml + +
冲洗量400ml + +
阳性对照 + +
大肠埃希菌菌液制备：取经35℃培养19~20h 的大肠埃希菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取0.4ml加盐水10ml混匀，做活菌计数备用。
取12支样品，每2支以100ml生理盐水溶解，冲洗100ml每次，做冲300、500ml、800ml二桶，各加入硫乙醇酸盐培养基100ml和β-内酰胺酶2支。分别加入大肠杆菌菌液（肉汤培养物10倍稀释至10-7）1ml。结果见表5。
表5  实验结果（大肠埃希菌菌数54CFU）
培养时间 14h 25h 38h 110h
冲洗量300ml - - - -
冲洗量500ml - - + +
冲洗量800ml - + + +
阳性对照 + + + +
11 结论：
头孢噻肟钠无菌原料无菌检查法:,取样量3.0克，采用薄膜过滤法（封闭滤器为北京牛牛基因技术有限公司生产）。冲洗液为0.9％的氯化钠溶液，冲洗量800ml，加酶量2支（大于300单位/ml）以大肠埃希菌为阳性对照菌

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