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【分享】个人的酚氯仿法提取全血中DNA Protocol
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1、将3~5mL全血加入50ML离心管中，加入30~40ML的ddH2O，振荡20秒，静置10分钟后，4度，3800rpm,20min，小心去上清。 2、沉淀中加入5mlTES,颠倒混匀（涡旋振荡，破碎细胞膜）。 3、加入350μl、10%的SDS和70μl（10ng/μl)蛋白酶K，37℃过夜。 4、将离心管冷却至室温，先加入5ml的Tris-饱和酚，颠倒混匀后，（必做,否则将影响最后的分层,不利于上清液的抽提）再加入5ml氯仿异戊醇（24：1），颠倒混匀，4度，2500rpm,离心15min。 6、取全部上清至另一离心管中，加入2.5倍体积的冰无水乙醇，反复颠倒，析出DNA团状物后直接用移液器挑入1.5ml的离心管中,用75%乙醇洗涤两次,晾干后加入200μl或300μl TB溶解，放4度数日后测OD。测完OD后，原液放置-20℃或-80℃保存。 7、如若未析出DNA团状物或团状物太小不能挑出,则4度,3500rpm，离心15分钟，去上清，晾干后加入200μl或300μl TB溶解，可放56度水浴10分钟助溶或（37度，110转）摇床过夜或放4度数日后测OD。测完OD后，原液放置-20℃或-80℃保存。 相关试剂的作用: 酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含DNA的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 SDS溶液是十二烷基磺酸钠的去离子蒸馏水溶液。是一种已知的能够变性蛋白的去污剂。主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。可用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。也可用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及解离核酸,蛋白复合物。 蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。 最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA, EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。 |
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2010-03-23 15:02
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