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pidou213木虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】关于PCR
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请问： 1、PCR的条件优化有什么捷径没有？ 2、pcr中各类物质的加样顺序可否颠倒，为什么？  |
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阳光金鱼唐
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热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效（图20）。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制以及在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用Platinum Taq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。 镁离子浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能够在比Taq DNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化（图21）。 引物退火温度 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。 设定Tm有几种公式。表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在Gibco/BRL定制引物的质检报告中包含了消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作为标准，在EB染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。 引物纯度和稳定性 定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的（表6）。使用Invitrogen? Parallel Array Synthesis?技术，不必除盐。同其他方法相比，在Parallel Array Synthesis?技术中，通过脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。 |
3楼2010-03-16 12:42:49
yujiaping1
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pidou213(金币+1):谢谢回复 2010-03-16 12:45
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颠倒了问题不大，但一般都先加水，这样使得反应体系中的各种物质都处于比较低的浓度，有个相对缓和的条件，比如说盐浓度太高，会改变酶的构象等，另外最好最后加酶，尽量是加完酶就马上进行PCR 条件优化： 1）退火温度，我认为降落PCR是一个捷径，可以增加特异性，减少筛选条件，我通常都是升高一段温度进行降落，降到比设计的温度低的温度进行PCR，一般不需要筛选温度条件； 2）模板浓度，保证质量的前提，稀释1到50倍，问题都不大，可用分光光度计先定量 3）镁离子，按说明书一般不用变，条带多可适当降低，条带浅，可多加 4）引物，一般不用调整，但是条带浅，无引物带的，可以多加 5）酶，一般不用调整，可适当多加，如果实验稳定，可减少用量，节约成本 |
2楼2010-03-16 12:40:40
阳光金鱼唐
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4楼2010-03-16 12:44:54
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