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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】topo vector 克隆只产生白斑
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】topo vector 克隆只产生白斑

用盒子自带control DNA 连接 转染后得到如说明结果，数百菌落，95%蓝斑，5%白斑，
但是实际克隆目的基因时，只产生白斑，没有篮斑，其中白斑中有少量假阳性存在。相同目的基因用PGEMT easy 载体克隆可得到蓝白斑。我已经做过几十次了，每次都是这样的结果。网上搜寻未果，询问很多前辈，答：无蓝斑，原因不知。有高手知道原因么？
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1楼 2010-03-10 18:57:28
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yang0071 at 2010-03-11 11:29:01:
因为加入的目的片段远远大于载体量，载体基本上都和目的片段连接，没有蓝斑很正常；pGEM T easy只所以有蓝斑，说明一小部分载体自连了，从这点上看 topo载体好于pGEM T easy载体
实际操作时只要能连接上，管他啥 ...

貌似载体自连为假阳性，线性载体才是蓝斑，请确认。
试验中无论如何修改体系， 即改变DNA和Vector的比例，白色结果不变，只是菌斑的数量变化很大，难道topo线性载体无法转化感受态细胞？
但如何解释对照试验大量蓝斑的存在？
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5楼2010-03-12 10:13:50
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yang0071

木虫 (职业作家)
yujiaping1(金币+1): 2010-03-11 10:08
盒子自带control DNA 连接效率不高或者DNA量不够
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2楼2010-03-10 19:22:04
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yang0071 at 2010-03-10 19:22:04:
盒子自带control DNA 连接效率不高或者DNA量不够

95%蓝斑是盒子说明书的预期效果，你的意思是TOPO
克隆没有蓝斑是正常现象？
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3楼2010-03-11 09:57:52
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yang0071

木虫 (职业作家)
yujiaping1(金币+1): 2010-03-11 12:50
因为加入的目的片段远远大于载体量，载体基本上都和目的片段连接，没有蓝斑很正常；pGEM T easy只所以有蓝斑，说明一小部分载体自连了，从这点上看 topo载体好于pGEM T easy载体
实际操作时只要能连接上，管他啥载体
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4楼2010-03-11 11:29:01
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