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yujiaping1

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】topo vector 克隆只产生白斑

用盒子自带control DNA 连接 转染后得到如说明结果,数百菌落,95%蓝斑,5%白斑,
但是实际克隆目的基因时,只产生白斑,没有篮斑,其中白斑中有少量假阳性存在。相同目的基因用PGEMT easy 载体克隆可得到蓝白斑。我已经做过几十次了,每次都是这样的结果。网上搜寻未果,询问很多前辈,答:无蓝斑,原因不知。有高手知道原因么?
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by yang0071 at 2010-03-11 11:29:01:
因为加入的目的片段远远大于载体量,载体基本上都和目的片段连接,没有蓝斑很正常;pGEM T easy只所以有蓝斑,说明一小部分载体自连了,从这点上看 topo载体好于pGEM T easy载体
实际操作时只要能连接上,管他啥 ...

貌似载体自连为假阳性,线性载体才是蓝斑,请确认。
试验中无论如何修改体系, 即改变DNA和Vector的比例,白色结果不变,只是菌斑的数量变化很大,难道topo线性载体无法转化感受态细胞?
但如何解释对照试验大量蓝斑的存在?
5楼2010-03-12 10:13:50
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yang0071

木虫 (职业作家)

yujiaping1(金币+1): 2010-03-11 10:08
盒子自带control DNA 连接效率不高或者DNA量不够
2楼2010-03-10 19:22:04
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by yang0071 at 2010-03-10 19:22:04:
盒子自带control DNA 连接效率不高或者DNA量不够

95%蓝斑是盒子说明书的预期效果,你的意思是TOPO
克隆没有蓝斑是正常现象?
3楼2010-03-11 09:57:52
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yang0071

木虫 (职业作家)

yujiaping1(金币+1): 2010-03-11 12:50
因为加入的目的片段远远大于载体量,载体基本上都和目的片段连接,没有蓝斑很正常;pGEM T easy只所以有蓝斑,说明一小部分载体自连了,从这点上看 topo载体好于pGEM T easy载体
实际操作时只要能连接上,管他啥载体
4楼2010-03-11 11:29:01
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