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hiliu2000铜虫 (小有名气)
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FISH操作规程
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FISH 操作规程 实验原理：染色体FISH，是用带标记的物质将目的DNA 片段标记，然后将其特 异的杂交到染色体上，在用带荧光的特意性抗体对标记物进行检测，从而判断目 （主要为FISH 专用的一些试剂，其他常规试剂配置略） PI: (1) 加0.42g NaHCO3 于10ml H2O 中，NaOH 调pH 至9.0。 (2) 加50mg p-phenylenediamine 于5ml 0.5mol/L PBS，(3)用(1)液调 至8.0。 (3) 把（2）加到45ml 甘油中，(4)过滤（孔径0.8μm）备(5)用。 (4) 加125ug PI 至（3）（终浓度2.5ug/ml）。 变性液杂交液 formamide 7ml 5ml 0. 5M PBS 1ml 1ml 20 x SSC 1ml 1ml ddH2O 1ml 1ml 硫酸葡聚糖0 1g 20×SSC ：NaCl 175.3g 柠檬酸钠88.2g ddH2O 至1000ml HCl 调pH 值至7.0 试剂名称规格厂家批号 胎盘DNA 1/管SIGMA 36H3891 NH4Ac 汕头市西陇化工 厂 酒精500ml/瓶湖南师大 RNaseA 25mg/管华美MM0521 Tritin X-100 5Kg/桶DERVA 37240 甲酰胺（洗脱用） 500g/瓶GIBCOBRL 15515-026 甲酰胺(杂交变性液GIBCOBRL CD1204 第19 页共87 页第一部分细胞遗传实验室实验操作 19 成分) Avidin-FITC 2ml/瓶SIGMA A2050 ANTI-Avidin-FITC 0.5ml/瓶SIGMA F1269 ANTI-MouseIgG-FITC 2ml/瓶SIGMA F7509 BSA 25g SIGMA B1125 Biotin-16-dUTP 50ul/50nm Roche CAT1093037 硫酸葡聚糖100g/瓶SIGMA D8906 NaCl 500g/瓶SIGMA S5886 柠檬酸钠500g/瓶SIGMA S4641 实验耗材及其仪器： 染缸20 个，蜡膜，载玻片，盖玻片，原位PCR 仪器，大中小Tip 及其吸枪， 湿盒，水浴箱，温箱，PCR 仪及其对应大小的EP 管，高速离心机，宽胶带，冰 箱，荧光显微镜以及有关配件（摄相头及荧光图片采集软件、专用电脑） 实验操作过程： 1、外周血染色体玻片标本制备 1）常规收获外周血，调定细胞悬液浓度。 2）用100μl 移液器吸7μl 滴片，稍干。 将玻片依次放入70%，90%，100%酒精中各3 分钟，保存于- 70℃。 2、探针的检测 1） 测OD 2） 凝胶电泳检测 3） 酶切 4） 测序或PCR 证实 3、标记和纯化探针 方法一缺口平移标记法 专用的试剂：NICK 试剂盒Roche CAT 976776 50 labeling assays Boehringer Mannheim 公司的缺口平移标记试剂盒(Nick translation kit)标记 探针。 1）配dNTP mixture: 0.4mmol/L Bio-16-dUTP 1 体积 0.4mmol/L dTTP 2 体积 0.4mmol/L dATP 3 体积 0.4mmol/L dGTP 3 体积 0.4mmol/L dCTP 3 体积 2）在0.5ml Eppendorf 管中加入： DNA 模板0.1-2 ug dNTP mixture 10μl 10×buffer 2μl 加H2O 至终体积18μl 加DNase I 和DNA polymerase I mixture 2μl 15℃，90 分钟（片段长 200-500bp 为宜)。 3）加1μl 0.5M EDTA(pH8.0), 65℃加热10 分钟,终止反应。 4）加10μl NH4Ac（7.5mol/L），300 倍模板DNA 量的胎盘DNA，加2 倍体 积无水乙醇，-70℃沉淀30 分钟。 5）Beckman 台式GS-15R 离心机，4℃ 13000rpm 离心20 分钟，去上清。 6） 加70%乙醇60μl，13000rpm, 4℃ 离心5 分钟，吸去上清。 7）加30μl 杂交液溶解。 方法二PCR 标记法 专用的试剂：10 x buffer[Mg2+（-）] 1ml/管TaKaRa A2101 MgCl2 1ml/管TaKaRa A3701-1 Taq 酶200u/管TaKaRa TDR01 100mMd dNTP Set 4 管/盒25umol/管GIBCOBRL D0056 引物自行申请订购5’CGGGAATTCTGGCTCTGCGACATG3’ （http://www.cpc-info.com/cpcinfokj/863wz/070403.html） 1）模板buffer MgCl2 dnTP Biotin-duTP 引物酶（Taq） H2O （μl） 0.5 2 2 2 1 1 0.5 11 （dNTP 中四种底物以1：1：1：1 混合，终浓度为2mM） 2）加灭菌石蜡油15μl 封闭（视情况而定） 3）上PCR 机 95℃ 5min ↓ 94℃ 45s ↙ ↘ 30 cycles 55℃ 30s → 72℃ 1min ↓ 72℃ 7min ↓ 4℃ 保存 4、纯化沉淀探针 1）加10μl NH4Ac（7.5mol/L），300 倍模板DNA 量的胎盘DNA，加2 倍体积无 水乙醇，-70℃沉淀30 分钟。 2）Beckman 台式GS-15R 离心机，4℃ 13000rpm 离心20 分钟，去上清。 3） 加70%乙醇60μl，13000rpm, 4℃ 离心5 分钟，吸去上清。 4）加30μl 杂交液溶解。 5、杂交 第21 页共87 页第一部分细胞遗传实验室实验操作 21 1）预杂交 含探针和胎盘DNA 的杂交液，76℃变性7 分钟，置冰上3 分钟， 再于 37℃退火30 分钟。 2）杂交 (1) 染色体玻片标本处理：玻片标本用RNase A 100ug/ml 37℃消化1 小时， 过70% 90% 100% 乙醇脱水3 分，空气干燥，加变性液69℃-72℃变性2min。立 刻放入-20℃预冷的70%、90%、100%的酒精中各3 分钟，空气干燥。 (2) 将预杂交后的探针8μl 滴于已变性的染色体玻片上，加蜡膜封盖，再 用胶带封严，37℃，14-17 小时。 6、洗杂交片41℃ 2×SSC/50%甲酰胺，5 分钟，洗2 次。 0.1×SSC，5 分钟，洗2 次。 2×SSC/0.05%Triton X-100(Difco 公司) 5 分钟，1 次。 7、信号倍增41℃ 避光操作 1） 加80μl 1:100 的生物素抗亲和素-FITC(Sigma 公司)（2.5% BSA/4×SSC） 37℃, 30 分钟。 2）0.05% Triton X-100/2×SSC, 3 分钟洗2 次。或者2×SSC /0.05% Triton X-100, 5 分钟洗2 次。稍干，成雾状。 3）加80μl 1:100 鼠抗生物素-FITC(Sigma 公司)（2.5% BSA/4×SSC）, 37℃,30 分钟。 4）0.05% Triton X-100/2×SSC, 3 分钟洗2 次。或者2×SSC /0.05% Triton X-100, 5 分钟洗2 次。稍干，成雾状。 5）加80μl 1:100 兔抗鼠-FITC(Sigma 公司)（2.5% BSA/4×SSC）， 37℃,30 分钟。 6）0.05% Triton X-100/2×SSC, 3 分钟洗2 次。或者2×SSC /0.05% Triton X-100, 5 分钟洗2 次。稍干，成雾状。 7）70%，80%，90%，100%酒精中各3 分钟。 10）空气干燥后，加10μl PI(碘化丙啶)，盖上盖玻片，染色10 分钟。 8、结果观察 在荧光显微镜选取分散好，染色体长度适中，背景干净信号强的分裂相照相。 染色体FISH，实验结果一般以染色体形态好，信号清晰，各分裂相上的信号位 置同一为准。 间期核FISH，一般是数100 个分裂相，分别计数信号数目多少来分析判断。 注意事项： 玻片准备时要注意玻片的干净和透明度。 杂交过程中要保持湿润。 杂交必须对玻片变性温度的摸索。 注意洗脱液PH 值，并注意其洗脱温度。 抗体最好是要离心后取上清，以避免大的荧光杂信号影响结果。 |
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