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sarahliu2009

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[交流] 【求助/交流】求助引物设计

我刚刚开始做分子生物学实验, 对这方面的知识了解太少,目前正在学习中. 我是将一段大约80bp的公司合成的核苷酸片段连到表达载体上的酶切位点中间, 转化后有很多单斑出现, 看论坛上说可以先做个菌落PCR筛选,所以送样品测序之前想做一个. 但是不知应该如何设计引物, 请各位好心人帮我入入门, 十分着急. 非常感谢!!!!!! 我的载体是pET28a, 序列2中红的部分为准备连入的核苷酸片段.(其中一个引物可以是T7 forward primer吗?)

Coding DNA Sequence for His6-B1M

-60 -46
atg ggc agc agc cat cat cat
tac ccg tcg tcg gta gta gta
M G S S H H H
-20 -16

-30 -15 NdeI
cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg cgc ggc agc cat atg ggc
gta gta gtg tcg tcg ccg gac cac ggc gcg ccg tcg gta tac ccg
H H H S S G L V P R ^ G S H M G
His-6 tag -10 Thrombin Site -1

nt# HindIII 15 30 45
gca caa ttc aag ctt atc atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa
cgt gtt aag ttc gaa tag tag ttg cca ttt tgg gac ttt cca ctt
A Q F K L I I N G K T L K G E
aa# 5 10 15
↑
B1 Start

60 75 90
atc acc atc gaa gct gtt gac gct gct gaa gcg gaa aaa atc ttc
tag tgg tag ctt cga caa ctg cga cga ctt cgc ctt ttt tag aag
I T I E A V D A A E A E K I F
20 25 30

105 120 135
aaa cag tac gct aac gac aac ggt atc gac ggt gaa tgg acc tac
ttt gtc atg cga ttg ctg ttg cca tag ctg cca ctt acc tgg atg
K Q Y A N D N G I D G E W T Y
35 40 45

150 165 180
gac gac gct acc aaa acc ttc acg gta acc gaa tag ctc gag cgg cgg
ctg ctg cga tgg ttt tgg aag tgc cat tgg ctt atc gag ctc gcc gcc
D D A T K T F T V T E TER XhoI
50 55 56
↑
B1 End

Proposed Sequence for His6-TEV-CCR5(20-31)-B1M

-60 -46
atg ggc agc agc cat cat cat
tac ccg tcg tcg gta gta gta
M G S S H H H
-20 -16

-30 -15 NdeI
cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg cgc ggc agc cat atg ggc
gta gta gtg tcg tcg ccg gac cac ggc gcg ccg tcg gta tac ccg
H H H S S G L V P R ^ G S H M G
His-6 tag -10 Thrombin Site -1

gag aac ctg tac ttc cag
E N L Y F Q
TEV cleavage site

tgc caa aaa atc aat gtg aag caa atc gca gcc cgc ggc ggc ggc
C Q K I N V K Q I A A R G G G
CCR5(20-31)

nt# HindIII 15 30 45
gca caa ttc aag ctt atc atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa
cgt gtt aag ttc gaa tag tag ttg cca ttt tgg gac ttt cca ctt
A Q F K L I I N G K T L K G E
aa# 5 10 15
↑
B1 Start

60 75 90
atc acc atc gaa gct gtt gac gct gct gaa gcg gaa aaa atc ttc
tag tgg tag ctt cga caa ctg cga cga ctt cgc ctt ttt tag aag
I T I E A V D A A E A E K I F
20 25 30

105 120 135
aaa cag tac gct aac gac aac ggt atc gac ggt gaa tgg acc tac
ttt gtc atg cga ttg ctg ttg cca tag ctg cca ctt acc tgg atg
K Q Y A N D N G I D G E W T Y
35 40 45

150 165 180
gac gac gct acc aaa acc ttc acg gta acc gaa tag ctc gag cgg cgg
ctg ctg cga tgg ttt tgg aag tgc cat tgg ctt atc gag ctc gcc gcc
D D A T K T F T V T E TER XhoI
50 55 56
↑
B1 End

拜托大家了！

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