| 查看: 443 | 回复: 1 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
[交流]
【分享】焦磷酸测序原理及实验流程
|
|||
|
原理简介： 1．测序引物与单链，PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。 2．四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。 3．ATP sulfurylase在adenosine 5´ phosphosulfate存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动luciferase介导的Luciferin向oxyluciferin的转化，oxyluciferin发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 4．ATP和未掺入的dNTP由Apyrase降解，淬灭光信号，并再生反应体系。 5．然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意的是，在体系中使用的是dATP S而非dATP，因为dATP S不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATP S的催化效率更高。而且在系统之中，底物的浓度已经最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。 实验流程： 1．在使用前，保证所有试剂都达到室温； 2．在PSQ 96板中预先加入45μl含有0.3μM测序引物的annealing buffer； 3．使用Vertex混匀Sepharose beads； 4．将需要使用的sepharoe beads总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中； 5．在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀； 6．将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl； 7．将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合，对于较长片段，可适当延长混匀时间； 8．在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer； 9．打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30s； 10．然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads; 11．拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上； 12．将vacuum prep tool放入70％乙醇中5s； 13．然后移到denatureation buffer中5s； 14．再移到washing buffer中清洗5－10s；关掉泵； 15．将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads; 16．使用高纯水清洗vacuum prep tool； 17．将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行Pyrosequencing反应。 |
回复此楼» 猜你喜欢
献血感触
已经有6人回复
-
2026山东省优青
已经有4人回复
-
评审有感
已经有16人回复
-
反应很差，大量原料没有反应
已经有3人回复
-
Sci. Bull. 悲剧经验
已经有4人回复
-
找博士生导师
已经有7人回复
-
上海大学实验技术岗位非升即走
已经有11人回复
-
26/27申博自荐-锂/钠电池方向
已经有4人回复
-
同样的基金本子，换个专家直接从C变A！
已经有3人回复
-
别被青基扩招骗了！26年科研内卷才刚刚开始
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
holyala
木虫 (著名写手)
砖家
- BioEPI: 1
- 应助: 19 (小学生)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 1128.7
- 散金: 322
- 红花: 20
- 帖子: 1868
- 在线: 268.2小时
- 虫号: 457557
- 注册: 2007-11-12
- 性别: GG
- 专业: 基因组学
2楼2010-02-03 17:48:53
5