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铁虫 (初入文坛)

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[交流] 【分享】焦磷酸测序原理及实验流程

原理简介：
1．测序引物与单链，PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。
2．四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。
3．ATP sulfurylase在adenosine 5´ phosphosulfate存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动luciferase介导的Luciferin向oxyluciferin的转化，oxyluciferin发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
4．ATP和未掺入的dNTP由Apyrase降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
5．然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意的是，在体系中使用的是dATP S而非dATP，因为dATP S不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATP S的催化效率更高。而且在系统之中，底物的浓度已经最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。
实验流程：
1．在使用前，保证所有试剂都达到室温；
2．在PSQ 96板中预先加入45μl含有0.3μM测序引物的annealing buffer；
3．使用Vertex混匀Sepharose beads；
4．将需要使用的sepharoe beads总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；
5．在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；
6．将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；
7．将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合，对于较长片段，可适当延长混匀时间；
8．在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；
9．打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30s；
10．然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads;
11．拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上；
12．将vacuum prep tool放入70％乙醇中5s；
13．然后移到denatureation buffer中5s；
14．再移到washing buffer中清洗5－10s；关掉泵；
15．将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads;
16．使用高纯水清洗vacuum prep tool；
17．将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行Pyrosequencing反应。

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