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[交流] 【求助/交流】关于荧光定量分析中的溶解曲线

请问荧光定量中的溶解曲线的作用是什么？怎么分析？

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1楼 2010-01-26 16:49:53

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qqsvery

木虫 (著名写手)

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1.简单的说来，熔解曲线就是在采用荧光染料法进行实时定量PCR时采用的一种分析手段。当体系的温度逐渐升高的时候，体系中的PCR产物慢慢的由双链变成单链，这是一个逐渐变化的过程。由于荧光染料能插入到双链DNA中而发光，单链不发光，因此可以看到荧光的变化。在实时荧光PCR仪中都应该自带分析软件，看溶解曲线主要是看其峰在什么位置，不同的核酸会有不同的峰。同一核酸的峰差别应该不大，一般能控制在正负0.5度内。

2.熔解曲线是做染料法定量pcr时，用到的一种结果分析方法。

一般染料法定量pcr在进行完pcr后都要运行熔解曲线，一般设定先94度几分钟，然后骤冷到65度（假定65度为退伙温度）。在65度时，pcr产物是以双链的形式存在的，因为染料是插到双链dna的小沟里然后发荧光的，所以这个时候检测到很强的光信号，随着温度升高，双链逐渐打开，荧光信号逐渐减弱。因为理论上要检测的样本长度一定，所以到达某一个温度的时候，应该全部解链，我们假设在88度的时候pcr产物全部解链，这个时候就是我们在熔解曲线图上看到的所有曲线同时骤然下滑的那个点，一般把最高温设定在94度左右。如果下滑点不在一个温度，说明不是一种产物。

我们也可以通过取log的图来查看，可以更加明显的看到pcr产物是否特异。