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【求助】小鼠脑内神经类单胺递质测定方法？？
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请教做过小鼠脑内神经类单胺递质测定的朋友，你们都是用什么方法测的？ 我是用荧光分光光度法做的，具体操作如下： (1)前处理 将脑组织去除血膜、嗅球和小脑后，置于液氮中，再称重，以5倍量酸化正丁醇(以l000ml正丁醉中加入浓盐酸0.85ml)在冰水浴中制成匀浆。旋涡振荡5min，离心5min(3000r/min)。取上清液2.5ml，放入另一带塞离心管内，加正庚烷5ml和0.lmol/L盐酸1.2ml，旋涡振荡5min，离心5min，得到分层溶液(水相1含5-HT，DA，NE)。 (2)标准贮存液 5-HT、DA、NE分别用0.0lmol/L盐酸配制成500μg/ml作为标准储存液。存放于2℃冰箱中。 (3 )标准应用液 临用时各取上述贮存液0.25ml，用0.01mol/LHCL稀释至100ml标准应用液。每个标准品浓度1.25μg/ml。 (4 )脑组织中5-HT、NE和DA的测定 ①5-HT的测定 取水相10.5ml加入0.5%半胱氨酸(新鲜配制)0.1ml，0005%邻苯二甲醛3ml(以l0mol/L盐酸临时配成)，0.02%高碘酸钠0.lml，沸水浴l0min，冷却至室温，测定。0.5%半胱氨酸，用0.1mol/L盐酸配制。 标准管和空白管 标准管取标准应用液0.5ml，空白管取重蒸馏水0.5ml；加酸化正丁醇4.5ml，旋涡振荡5min，离心5min(3000r/min)。取上清液2.5ml，放入另一带塞离心管内，加正庚烷5ml和0.lmol/L盐酸1.Oml，旋涡振荡5min，离心5min，得到分层溶液(水相1含5一HT、DA、NE)。取水相Ⅰ0.5ml加入0.5%半胱氨酸0.lml，0.005%邻苯二甲醛3ml(以10mol/L盐酸配成)，0.02%高碘酸钠0.1ml，沸水浴l0min，冷却至室温，测定5-HT最大发射波长(em)475nm，最大激发波长(cx)355nm。 ②NE和DA的测定 取水相I0.5ml，加入1/15mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH7.2)1.7ml，0.lmol/L EDTANa2(以lmol/L醋酸钠溶液配制，以10mol/LNaoH调pH至7.0)0.4ml，加碘试剂0.lml，静置2min，加碱性亚硫酸钠溶液0.5ml(25%亚硫酸钠1.0ml，5mol/L氢氧化钠9ml临时混匀)，静置2min。加入6mol/LHAc液0.5ml，沸水浴20min，冷却至室温，分别测定NE，DA. 碘试剂: 配制0.02mol/L碘液和5%碘化钠(以70%乙醇溶解)，临用前以1:1体积比混合。 标准管和空白管:标准管取标准应用液0.5ml，空白管取重蒸馏水0.5ml，以酸化正丁醇4.5ml，旋涡振荡5min，离心5min(3000r/min)。取上清液2.5ml，放入另一带塞离心管内，加正庚烷5ml和0.lmiol/L盐酸1.2ml，旋涡振荡5min，离心5min，得到分层溶液(水相Ⅰ含5-HT，DA，NE)。 取水相Ⅰ0.5ml，加入l/15mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH7.2)1.7ml，0.lmol/LEDTANa2 (以lmol/L醋酸钠溶液配制，以10mol/LNa0H调PH至7.0)0.4ml，加碘试剂0.2ml，静置2min，加碱性亚硫酸钠溶液0.5ml(25%亚硫酸钠1.0ml，5mol/L氢氧化钠9ml临时混匀)，静置2min。加入6mol/LHAc液0.5ml，沸水浴20min，冷却至室温，分别测定NE，DA。NE最大发射波长(em)475nm，最大激发波长(ex)385nm；DA最大发射波长(em)370nm，最大激发波长(ex)322nm。 ③计算公式 样品单胺类递质含量(μg/g脑组织)=(Ri一Rib)/(RrRrb)×05(ml)×1.25(ug/ml)÷实际脑重 Ri:为供试品荧光读数；Rib:为供试品空白荧光读数; Rr:为对照品荧光读数；Rrb:为对照品空白读数。 |
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