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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双片段＋载体连接
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【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 Sebastian 的 75 个金币

Sebastian

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双片段＋载体连接

现在手上有一个片段3.3kb，两端是Pst1和Msc1酶切位点，一个片段0.9kb，两端是Msc1和EcoR1酶切位点，都用相应的酶切过了，其中Msc1切出来的是平末端。想把两个片段的平末端连起来，然后再和Pst1和EcoR1酶切过的载体连起来（载体3.2k），想请教诸位分子克隆方面的高人：我头两个片段的连接要做多久比较合适？DNA添加的比例怎样？做一个小体系的话我的连接产物需不需要纯化一下再和载体做二次的连接？用什么纯化？不纯化的话直接加载体的话体系应该怎么算？
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1楼 2010-01-24 21:50:47
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biogefart

木虫 (著名写手)
你这样做很悬，为什么不在载体上进行连接呢？片段连接后不用质粒扩增回收的可能性比较小
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闹太套
2楼2010-01-24 21:53:23
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
同感，为什么不将两个片段依次连接到载体上呢？
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Thank-you，so-blue.
3楼2010-01-24 23:02:08
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Sebastian

银虫 (小有名气)
如果没有合适的检验方式的话，第一个片段和载体的连接成功与否未知的状况下加第二个片段的话其实就等于把三个片段一起加进去连
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4楼2010-01-24 23:25:06
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
Sebastian(金币+25):现在已经这样做了，谢谢指导 1-25 15:45
可以设计四对引物用soe-PCR把两个片段连接起来。然后在酶切连接到载体上。
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梦在路就在！
5楼2010-01-25 08:19:12
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Sebastian

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2010-01-25 08:19:12:
可以设计四对引物用soe-PCR把两个片段连接起来。然后在酶切连接到载体上。

现在已经这样做了，谢谢指导
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6楼2010-01-25 15:46:02
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yinzhiminghao

铁杆木虫 (职业作家)
帮你顶一下
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人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。
7楼2010-01-29 18:12:57
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