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新药发现阶段类药性评选
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国外医学药学分册2003年8月第3o卷第4期 新药发现阶段类药性评选 恽榴红编译 (军事医学科学院毒物药物研究所，北京1(113~ ) 摘要：类药性对药物体外体内药理学有重要影响。类药性评选成为国外新药发现研究战略的新组 分。类药性数据有助于分析新药研发阶段化合物的性质，指导优先选择和优化结构。本文综述了 类药性研究范畴、体外体内高通量测量方法及它对新药发现的指导作用。 关键词：类药性；新药发现 中图分类号：R914．2 文献标识码：A 文章编号：10o1聊1(2003)04一o2l1-()3 目前，国际上将新药发现阶段分为4段：(1)苗 头(hit)选择；(2)先导物(1ead)选择；(3)先导物优化； (4)开发(development)目标选择。为了提高研发效 率和候选药(candidate)的质量，国外新药发现研究 机构对每一部分的试验内容、仪器方法、升级标准都 会作严格挑选。鉴于以往很多候选药因低劣的药代 动力学性质和安全性问题被淘汰，研发机构正在大 力开发能够测量化合物关键类药性(druglikeness)的 方法。这些结构一性质关系(sPR)数据可以补充构效 关系信息。建立类药性评选策略便于研究团队更好 地计划和解释新药发现实验，适时选择终止品种，精 心改进性质缺陷，从而选出最好的候选药进入新药 开发。 1 类药性 药物数据库研究表明，那些市场成功药物倾向 于有类药性。类药性是一个模糊概念。从生物学角 度看，它是药代动力学性质和安全性的总和，它来自 化合物理化性质和结构因素的相互作用，包括溶解 度、通透性和稳定性等，它们可以用体外方法研究。 这些性质又演绎于基本分子性质如分子量、氢键和 极化度等，它们可以用计算机方法研究。许多研发 机构在合成或筛选化合物库以后想很快获得关键类 药性数据，用于优选化合物、解释活性和药性结果、 判断由个别情况产生的复杂过程、寻找活性和类药 性关系以便优化结构、深入了解化合物特性、提醒研 究团队中止项目、选择化合物投入昂贵的体内试验、 预测体内药代动力学、指导结构修饰、比较前药和提 高候选药质量利于成功等。 收稿日期：2003-04-16 2 类药性测量 对测量方法一般要求。与开发阶段不同，新药 发现阶段经常处理成百成千化合物，样品量少 (mg)，时限短(几天或几周)，所以测量方法必须高 通量，样品用量少，成本低，速度快。要特别注意实 验条件的选择和掌握，开发新测量方法要经过验证。 性质估计测量有3类方法：(1)定性简易方法，如 Lipinski定性规则(rule of five)、旋转键法、极性表面 面积；(2)计算机法，主要预测虚拟化合物性质，预测 模型仍在不断改进；(3)高通量法，一般指每天测量 50～1 000个化合物即可满足需要。方法应符合中 等水平的质量控制(Qc)要求。I_ogD和pKa等性质 可计算机预测，其他性质可实验测量。到了发现后 期，需要提供更详细更准确的类药性数据来决定候 选药，就应当采用高水平Qc的方法，样品用量较 多，测定时间较长。 3 理化性质高通量测量法 3．1 纯度 为了获得比较正确的构效关系，应确认样品纯 度。通常采用LC—uV—MS技术，制定样品接收标准， 如纯度8o％以上，分子量与结构相符。一旦由高通 量筛选(HTS)选为苗头化合物，即应测定其样品纯 度并在合成过程继续跟踪测定。 3．2 溶解度 以下几种方法可供选择：浊度法、散射法、直接 紫外法。后者的操作过程是在96孔板上加入缓冲 溶液，再加入20 g·LI1样品二甲亚砜(D O)溶液， 注意DMSO的终浓度应不超过0．5％ ，以免因DMSO 提高了样品溶解度。将混合溶液平衡18 h，滤去沉 淀，用uV平板测量仪定量。对化合物溶解度的要 l l I i誓1■ 疆■ ’ 维普资讯http://www.cqvip.com Foreign Medical&ien~ Seaion帆尸矾2003 AIJg；3O(4) 求与活性强度相关。Lip~ki认为，口服剂量为1 nag· kgI1的药物，其溶解度高于65 nag·LI1则不会成为胃 肠道吸收的限制因素，如果溶解度低于l0畔·LI1 则很可能是胃肠道吸收的限制因素。采用几种pH 条件测量溶解度是有益的，因为pH值明显影响化 合物在胃肠道不同部位的溶解度。 3．3 亲脂性 通常在一种化合物系列内，增大亲脂性即增大 细胞通透性、蛋白结合和分布容积，同时减小溶解度 和肾排泄。亲脂性通常的测量方法是测【0 ，【0gP 用于中性状态所有溶质，当因pH导致部分或全部 溶质离子化则使用logo，从Hansch的专著中可查到 许多化合物的文献值。有一种高通量摇瓶法 可在96孔板操作。反相HPLC保留值和计算机法 在很大范围的结构和亲脂性内都有效，可以在早期 发现阶段使用。 3．4 理化稳定性 如果化合物在测量溶液或给药溶液中发生化学 变化，来自HIS、酶／受体、细胞、动物的活性数据是 不准确的。在药物发现阶段，化合物降解的其他条 件包括胃肠道pH 2～8、实验室光照、贮藏条件。稳 定性测试可将96孔板放在各种相关条件进行，用 LC．MS测定化合物的含量变化。 3．5 pKa 离子态化合物比中性态易溶于水，离子化程度 取决于pKa和溶液pH。胺类的pKa值为10～11， 酸类的pKa值为3～5。一个有用的规则是对于一 元酸或一元碱，当pH等于pKa值时，其中性态和离 子态浓度相等。高通量测定pKa值方法有毛细管 电泳法和光谱梯度分析法。后者在2 rain内建立一 pH梯度，测定化合物在整个梯度范围内的Uv吸收 并计算出pKa。化学家可以据此修饰离子化基团来 改变溶解度和细胞通透性。 4 体外药代动力学性质高通量测量法 4．1 代谢稳定性 许多候选药因代谢速率高而呈低生物利用度。 测量代谢稳定性可采用肝微粒体、肝匀浆、89、肝细 胞和血浆。肝微粒体最价廉易得，S9和肝细胞可提 供更多信息，血浆含有另外一些酶类如酯酶和酰胺 化酶。稳定性孵温试验由实验室机器人自动完成。 定量测试需要高灵敏度(<1／an)和高选择性(克服 培养基成分干扰)，多用LC—MS-MS。有人报道30 s 内完成一个样品测试。DMSO浓度、样品浓度和微 粒体制法都影响代谢稳定性数据的正确性，方法不 当将发生误导。代谢速率和机制存在物种差异，啮 齿类动物在早期发现阶段代谢研究中用得最多，当 进人药物开发阶段和需要考察安全性时人体代谢研 究比较重要。 4．2 主要代谢产物筛选 代谢产物研究应当在先导物优化阶段完成，以 便设计比较稳定的类似物。代谢产物应尽量合成以 比较活性和毒性。LC．MS-MS可以快速解析代谢产 物结构，而且样品用量极小(10～100 tag)。如果MS 不能提供充分的结构细节，建议用LC．hqVlR，样品用 量1—100 。 4．3 通透性 体内通透性机制比较复杂，包括被动扩散、主动 转运和排出。大多数药物的口服吸收机制是被动扩 散。早期测定通透性的方法采用脂质体和固定化人 工膜(【AM)色谱，近年广泛采用的细胞模型是Caeo-2 和(犬肾细胞)。在多孔滤板上接种培养出单 细胞层，将待测化合物的缓冲溶液置单细胞层外 (A)侧，用HPLC或LC．MS测量化合物到达细胞层内 (B)侧的速率，再计算出通透率。细胞模型包含几 种透膜机制，需要在多种条件(如A—B、A、添加 P 糖蛋白抑制剂)下测量才能鉴别哪一种机制以利 结构优化，转运载体的表达条件必须监测。利宾斯 基认为，用100 tanol·LI1药物浓度的Caeo-2细胞实 验最适合预测1 nag· I1剂量药物的口服吸收情况， 而1 tanol·LI1浓度最适合预测药物穿透中枢神经系 统能力。已有文献报道96孔板上进行Caeo-2细胞 测定通透性的方法。平行人工膜通透性测量法 (PA A)受到很大注意，它不需要单细胞层，代之以 有机物稀释后的脂质人工膜，用uv平板读数器测 量。它比Caeo-2方法快速，成本只有后者的5％。 在发现阶段，研究化合物通透性的合理方案是采用 PAMPA高通量测定被动扩散能力，再对选中的化合 物用Caco-2细胞研究透膜机制。药物对血脑屏障 的通透性，需采用专门的细胞培养模型或专门修正 的PAMPA测量。 4．4 主动转运载体 P_糖蛋白是研究最多的载体之一，在肠道、血脑 屏障、耐药肿瘤细胞都起作用。有3种方法可测定 药物与P 糖蛋白的亲和力：ATP酶、Caleein AM和多 药耐药细胞MDR1一MDCK通透性，也有很多人用Ca- 维普资讯http://www.cqvip.com 国外医学药学分册2OO3年8月第30卷第4期 co-2细胞系研究P 糖蛋白，以避免因P_糖蛋白导致 通透性差的那些化合物系列。降低对P_糖蛋白的 亲和力可能改进生物利用度，增加脑部穿透和增加 对肿瘤细胞的活性。对药物吸收载体和排出载体的 研究仍在进行。 4．5 细胞色素氧化酶抑制 由于抑制伍用药物的代谢产生毒性而导致上市 药品撤出市场时有发生，因而加强了对代谢酶作用 的研究。方法是在加与不加待测化合物条件下测量 探针化合物经某种CPY450同工酶代谢生成荧光代 谢产物的速率，用荧光或MS检测荧光产物的减少 量即可计算酶抑制率。对高抑制率的化合物应进行 详细的毒理学评价。 4．6 血浆蛋白结合 药物血浆蛋白结合会降低分布容积、肝脏代谢 和组织穿透，而增加吸收和半衰期。以上因素有时 对药物浓度的影响相互抵消，因而可能对体内预测 造成混乱，但有助于分析体内效应的复杂性。测量 药物血浆蛋白结合率的方法有人血浆白蛋白HPLC 法、96孔板平衡透析法和96孔板超滤法。 5 体内药代动力学性质高通量测量法 为了满足高通量，体内试验中血浆或组织样品 的采集应当简化。通常采用乙腈沉淀或固相萃取处 理样品后连接LC—MS-MS测量。盒式给药或盒式处 理可大大加快药代动力学筛选的数量，节省时间和 费用。体内药代动力学研究对早期新药发现在以下 几方面大有益处：如果候选化合物的总体药代动力 学性质不佳，应当分析原因以便修饰结构改善药代 动力学性质，并可采用低成本的体外方法检测该系 列新化合物的性质；体内药代动力学数据有助于验 证动物模型、选择剂量水平、决定制剂要求；确认替 换动物品种代替费钱费时的动物模型；帮助分析体 内活性不好是否由于血液或组织内药物浓度低或由 于体内存在降低活性因素。 6 展望 虽然测量化合物类药性的方法发展很快，但目 前仍有缺陷。由虚拟计算和体外测量预测体内性质 的精确度亟待改进，如由Caco-2细胞和PAMPA法数 据预测体内生物利用度的相关性仅60％ 一70％；确 定各种类药性的优劣数值范围有待加强；测试模型 方法需继续简化、加快和降低成本以适应高通量； 有荧光等明显终点的高通量检测方法有待增加；代 谢诱导肾脏清除、胆汁清除、关键毒性机制等高通量 方法有待发展；药物化学家与计算化学家之问需要 更充分的沟通和合作；多维性质预测软件的改进和 使用将改善体内预测的精确度。 选择性非甾体类抗炎药戊地昔布 |
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