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【分享】PCR应用中存在的问题
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开展 PCR 应具有一定的条件。需要一个正规的 pCR 实验室，采集标本、核酸提取、扩增及产物分析应在不同的房间进行；需有严密的防污染措施、假阳性和假阴性结果的质控等。实验者应具有一定的分子生物学理论知识及实验技能，能够及时发现和纠正实验中的问题。目前，我国在 PCR 应用中尤其是在临床诊断中存在问题较多，主要表现为： PCR 试剂的考核、审查工作薄弱，许多单位实验条件不符合要求，部分操作人员的理论和实验知识水平较低。 PCR 的应用范围过宽等，因此造成 PCR 实验结果的可靠性差，出现较多的假阳性、假阴性结果。 一、假阳性： 实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 DNA 抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。预防措施：(1)工作区隔离。(2)改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化，如后加阳性对照等。 交叉污染的处理方法： 交叉污染指扩增产物对将要扩增的样品或反应管的污染。由于 PCR 的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。交叉污染的处理方法包括： 1 ．在 DNA 模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的 PCR 产物。一般选用波长 254nm 照射 30min （ Nature ， 1990 ， 34:27 ） 2 ． PCR 实验中使用 dUTP ，而不用 dTTP 。在扩增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）处理可降解交叉污染的 PCR 产物，而不降解基困组 DNA 模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（ Gene ， 1990 ， 93 ： 125 ）。美国 PE 公司提供此类试剂盒（ PCR carry-over preventionkit 。 3 ．在 PCR 反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联 DNA 链，使之不能再扩增（ Nucleic Acids Res ， 1991 ， 19 ： 99 ）。 二、假阴性： 如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。但这里应注意，许多国产 PCR 试剂盒中阳性对照采用质粒 DNA ，和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。 造成假阴性的原因包括: (1) DNA 抽提过程不当。 (2) DNA 样品中含有 Taq 聚合酶抑制剂，如尿素、 DMSO 、 SDS 等物质，可抑制 Taq 酶活性， DNA 样品中的蛋白质和重金属离子等亦影响 Taq 酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性。 设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。 三、PCR产物的鉴定 PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳可判断其长度是否为预期的长度，但只有通过杂交试验或序列分析等才能判断其特异性。严格说来， PCR 产物均应通过实验证实其特异性。在我国一些科研论文和临床检测中缺乏这一环节。 综上所述， PCR 具有其优点，但也有不足之处，它是一种很好的科研手段，但作为常规诊断方法尚需进一步改进和提高。目前的关键问题是如何正确应用 PCR 。虽然 PCR 尚未在包括美国等发达国家作为常规诊断方法，但如果具备开展 PCR 需要的条件， PCR 是可作为辅助诊断手段使用的。目前，只有针对 PCR 应用中存在的问题，采取措施，正确应用 PCR ，才能使这一技术在科研和临床工作中发挥应有的作用。 资料来源：www.yiqi120.com |
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