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【原创】运用崭新生物技术制备天然牛乳香精
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运用崭新生物技术制备天然牛乳香精 苏林 （ 广西师范大学. 桂林. 541001） The Use of New biotechnology for the Production of Natural Flavors and Fragrances Sulin （Guangxi Normal University. Guilin. 541001) Abstract Natural flavors and fragrances is the high-value fine chemicals and food additives. However, limited sources of raw materials and the high cost of extraction, use Natural flavors and fragrances is the high-value fine chemicals and food additives. However, limited sources of raw materials and the high cost of extraction, use of biological technology to produce such products will have broad prospects. On the fermentation engineering and enzyme engineering in the application of flavors and fragrances, and to explore the technical preparation of the new biotechnology of natural flavors and fragrances. Endophyte is a very rich diversity of microbial taxa, distributed in no external symptoms of infection within the health of plant tissue, and coevolution with the host plant, the existence and role of people has long been ignored. Now I found a plant in memory of a stable microbial community, it is by fungi, bacteria, protozoa and other components. After research and testing, found such a community and put in some natural plant material in a closed reactor fermentation under certain conditions, the formation of an ecosystems. This system in the fermentation reactor to the preparation of natural flavors and fragrances. The community as a whole as a result of synergies, we can use a variety of natural plant materials to produce a wide range of natural flavors and fragrances, and microbial ecology but also the technology and the organic combination of enzyme engineering in order to milk as raw material to produce the natural milk flavor . Key words:New biotechnology,Natural flavors and fragrances,Production,Ecosystems. 摘要 天然香精香料是高价值的精细化工产品和食品添加剂。但原料来源有限且提取成本高，利用生物技术生产这类产品具有广阔的前景。简述发酵工程和酶工程在香精香料中的应用，并探讨了崭新生物技术制备天然香精香料。 植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，分布于没有外在感染症状的健康植物组织内，并与宿主植物协同进化，其存在和作用长期以来一直为人们所忽视。现今我发现在某一植物内存在一稳定的微生物群落，它是由真菌、细菌、原生动物等组成。经研究与试验，发现将上述群落与某一些天然植物材料投放在封闭的发酵反应器中，在一定条件下，形成一生态系统。这一系统在发酵反应器中能制备天然香精香料。由于该群落的整体协同效应，可以利用各种天然植物材料来生产各种各样的天然香精香料，并且还能把微生物生态学技术、发酵技术、酶工程等技术有机地、紧密地起来，以牛乳为原料来生产天然牛乳香精。 关键词：崭新生物技术，天然香精香料，制备，生态系统 0.前言 香料、香精对食品、饲料、化妆品和制药工业极其重要。目前，世界上香料、香精的产量约151亿美元，占据了25%左右的食品添加剂市场，且逐年增长。遗憾的是，现今生产的香料、香精中约85%的产品是通过化学合成方法得到的。但是用化学法合成的香料存在以下严重的缺陷： 一是大量的化学合成物质滥用给人们的健康带来危害；二是化学方法合成中由于缺乏专一的底物，造成产品纯度下降；三是化学合成的产物中常含消旋混合物，如从中提取目的异构体或手性香料将是非常困难并且花费巨大；四是人们对化学合成的添加剂用于食品、化妆品等日益反感[1]。 随着人们生活水平的提高，对食品添加剂需求趋向于天然、健康、安全、营养和多功能性。天然香精香料是高价值的精细化工产品和食品添加剂，而原来从天然动、植物提取的天然香料，由于原料有限，提取成本高，远远满足不了市场的需求。因此，人们对香料的生物合成越来越感兴趣，同时生物技术将在天然香精香料研究和制备中发挥越来越大作用，这也是对生物技术发展的挑战和机遇。 1.原有的香料生物技术 对天然香料的定义： （1）原料必须为天然动、植物材料；（2）加工工艺 包括：蒸馏，萃取、发酵、酶解、水解、加热、焙烤；（3）产物 包括：果汁精油、精油、油树脂、萃取物、酶解物、发酵产物、馏出物、焙烤产物[2]。 生物香料是采用生物技术，以天然原料或合成原料制备的香料。生物技术是一个研究范围很广的技术门类，小到生物分子，大到生态系统。生物技术包括发酵工程、酶工程、细胞工程、蛋白质工程和基因工程。以天然原料作起始物使用发酵技术、酶技术制备的香料称为天然同等香料，有时亦简称天然香料。如果用化学合成原料作起始物，无论使用什么技术，其产品都不属于天然等同级，也就是说原料的天然性是产品天然的必要条件。 1.1.发酵工程制备天然香料 使用发酵技术制备天然香料的历史并不很长，然而却显现出强大的生命力和广阔的市场前景。发酵过程本质是一种生物转化，即把某些前体化合物通过生物化学反应转化为产物，然而，发酵至今还没有达到像化学反应那样，可以从石化燃料出发合成任何我们想要得到的化学结构。发酵一般从结构相似化合物出发经过一两步生化反应得到产物，如以阿魏酸为原料制备香兰素。发酵的另一个特点是它主要是一个降解过程，即把一些大分子降解为一些小分子，而其中某些小分子就是我们需要的产物。发酵的第三个特点是微生物生长所需要的碳源和氮源，有些被代谢成产物，有些被微生物消耗生成了副产物和能量。要认识微生物全部的代谢过程是一件不容易的事，然而检测发酵成分，忽视中间代谢过程，把发酵过程当成一种“黑箱 ” 处理，即仅关注输入和输出的关系，会相对容易些，今天，发酵仍然是生产天然食品香料、食品香精的主要手段之一。 发酵工程制备天然香料特点： （1）条件温和 有些在温和条件下实现水溶液中化学方法不可能完成的多步反应，反应安全，反应在常温、常压下进行，生产场地和设备没有防爆要求； （2）高度专一性和选择性 可以专一性选择底物、底物结合位点以及反应类型，如有些可生产天然手性香料； （3）环境友好 发酵完成，产品分离后形成的三废少； （4）无菌生产； （5）发酵设备具有通用性； （6）克服了长期以来从动、植物作为天然香料惟一来源而存在的有效成分含量低，分离困难，受气候和动、植物病害影响等缺陷。 目前能运用微生物发酵工程制备的天然香料主要有：天然乙偶姻、天然香兰素、天然苯乙醇等。下面分别介绍： 1.1.1天然乙偶姻 乙偶姻：化学名3-羟基-2-丁酮、甲基乙酰甲醇。乙偶姻是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，是国际上常用的香料品种，主要用作配制奶油、乳制品、酸奶和草莓口味的香料。乙偶姻的国际需求量约1000t，国内需求量约100t，国内合成乙偶姻市场价格为8万（人民币）/t，国际市场天然手性乙偶姻可以接受的价格为30万（人民币）/t。 微生物发酵法生产乙偶姻是生物法生产乙偶姻的一个重要方法，从自然界中筛选分离高产乙偶姻的微生物菌种多达20几种，可是能积累高浓度的乙偶姻的微生物为数不多，主要为 Klebsiella pneumoniae、Bacillus subtilis 和Hanseniaspora guillieromondii。目前乙偶姻最高发酵水平为80g/L，已经由上海爱普香料有限公司产业化，发酵工艺达到国际领先水平。 1.1.2天然香兰素 香兰素又名香兰醛，学名3-甲氧基-4-羟基苯甲醛。香兰素是一种广谱高档香料，广泛用于食品、烟草以及医药、日用品。国际需求量约12000t，但其中有0.2%从植物中提取得到，化学合成的香兰素12美元/Kg，天然香兰素1000~1500美元/Kg，全世界使用香兰素大约有20%是天然香兰素。 微生物发酵法被认为是目前最实际的天然香兰素的制备方法。生物法生产天然香兰素的研究主要集中在微生物种类和底物两方面，以阿魏酸为底物转化生产天然香兰素也是当今研究的热点之一。目前常用从米糠油中提取的天然阿魏酸作为发酵原料，经微生物 Sterptomyces 发酵制备天然香兰素，关键是发酵中的转化率。例如法国罗地亚公司和上海爱普香料有限公司，其最高发酵水平达到15g/L，质量转化率60%。 1.1.3天然苯乙醇 苯乙醇是一种具有玫瑰花香的芳香醇，大量用于食品、日化香精中，尤其在化妆品中用量最大。在美国市场，化学合成的苯乙醇市场售价为3.50美元/Kg，而天然的苯乙醇售价高达1000美元/Kg。 对微生物发酵法生产天然苯乙醇，近几年国外已成功研制出以苯丙氨酸、氟氨苯丙氨酸为原料，采用微生物啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae 发酵工艺制备出天然苯乙醇，但原料成本太高，转化率又不高，不适宜工业化生产。华宝香化科技发展（上海）有限公司经过多年的创新研发，成功完成了以烟草（烟梗、烟末）为原料的微生物发酵法生产天然苯乙醇，并于2004年7月28日获得了发明专利授权（ZL专利号02137575，5.授权公告CN1159447C）。该工艺包括利用农业副产物烟草作为生物转化的前体物质，添加适当培养基，选用合适的菌种（如产朊假丝酵母、酿酒酵母、中国克鲁维酵母中的一种），在一定的发酵工艺条件下进行发酵培养，降解了烟草中的木质素、果胶和多酚类化合物，并转化为苯乙醇。所得到的苯乙醇具有纯正的天然香味。可作为天然香料用于食品的加香，具有广泛的工业化发展前景[3]。 运用发酵工程制备天然香料存在一些困难，通常发酵液中香味化合物的浓度很低，致使提取过程的费用较高；其次，在技术上有些问题，微生物发酵生产香料过程有两个特点：一是许多香味物质的挥发性和较低的水溶性使其难以回收，二是产物对微生物本身具有抑制和毒害作用，常需使发酵液中终产物的浓度维持在较低水平，再次之，有些发酵工程原料成本高，经济上不合算。 1.2.酶工程和天然香料、手性香料 酶工程主要通过不同的酶促反应，如氧化、还原、水解、脱水反应，形成新的C—C键，并进一步转化为天然香料，其工程中酶具有高度专一性，有些酶的空间专一性又使制备手性香料成为可能。当前世界很多香料公司开发自己专用的酶，使其产品更具特色，不容易被模仿，尽管这些酶没有商品化，但使酶制备、酶应用的整体技术得到提高。因此，在酶工程中酶的制备是很关键的一环。我国某香料公司的技术中心，也在实验室中做类似天然奶香基的研发，从而制备出比原来奶酪的风味强度有显著提高的风味料，现在还不能工业化，或许是酶制剂产量低；或许是酶制剂成本高，或许是酶的活性不稳定。 1.2.1 手性香料 手性香料通常是以单一旋光对映体的形式存在于自然界中的，因为不同的旋光对映体或区域异构体能够显示出不同的感官特性，它们的对映体合成是互利的。生物催化是这一领域中的一种有效工具，它能催化大量立体、区域选择性的化学反应，而缺乏选择性的传统合成工艺是无法轻易实现的[4]。 薄荷醇又称为六氢百里酚，俗称薄荷脑，学名5-甲基-2-异丙基-环已醇，它是非常重要的环萜醇。在香料中应用的大多数为左旋体（l-）或合成的消旋体（dl-）。近年来，全球薄荷脑的年产量高达3.5万t，大大高于市场需求量。 大家知道l-薄荷醇（手性香料）几乎不能用化学合成得到。日本萜烯化学公司通过化学合成的dl-薄荷醇的外消旋混合物进行酶法拆分，得到光学纯度极高的l-薄荷醇，其过程为：将外消旋混合物酯化、形成乙酸酯，再利用微生物分离的非发酵藻酸单胞菌NoF-5的酯酶水解dl-薄荷醇乙酯为l-薄荷醇，该技术已达到工业化规模。另外，假单胞菌脱氢酶可以把l-薄荷酮转化成l-薄荷醇，此酶作用于未成熟辣薄荷提取的香精油（几乎只含有l-薄荷酮），得到光学纯度极高的l-薄荷醇。 |
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1.2.2天然香料 一个被深入研究的并被工业化的例子是蓖麻酸（蓖麻油的主要成分）的微生物转化由酵母如 Sporidiobolus salmoncolor 和 Yarrowia lipolytica 催化，经B-氧化为有桃香味的r-癸内酯（手性香料）。有报道收率大于10g/L。其R-对映体存在于桃子和其它许多水果中，S-对映体存在于多种芒果中。化学合成会得到外消旋混合物，天然r-癸内酯的潜在市场估计为10t/年。 1.2.3生物酶的局限 用酶工程制备天然香料，主要有香兰素、内酯、酯类香料、叶醇等，其实以上大多数天然香料的酶法制备都处于实验室研发阶段。原因有多种，但最主要的是生物酶的局限。 生物酶的局限有以下几个原因： （1）酶的活性的保持 酶分子在生物体内的环境中表现出高度的活性是因为酶所处的环境以及其他分子对它的调控，一旦离开那种环境，酶的活性将大大降低，甚至失活。 （2）酶制备的困难 酶制剂包括提取、精制、固定化等一系列复杂的工艺。目前发现的生物酶有几千种，生物体内几乎每一个生化反应都有酶的催化，但实验室制备出的酶不过几百种，而用于工业生产的商品酶仅有几十种（大部分为含有蛋白和少量其他酶的粗酶液制品，而不是纯酶）用于手性化合物拆分和不对称合成的酶又是其中极小一部分（只有脂肪酶和酯酶等几种）这使酶的应用产生很大的局限性。 （3）酶的稳定性问题 酶本质上是一个手性的、有催化功能的蛋白质。它的稳定性受到物理环境、化学环境和生物环境的考验，热、紫外线等物理条件的变化，有机溶剂、PH等化学条件的变化，微生物的腐败作用等可以使酶变性，从而引起活性降低，甚至失活。 （4）酶的成本问题 酶的生产原料一般来自动、植物和微生物，所以生产成本高，价格比化学催化剂贵，竞争力较差。 2.崭新生物技术制备天然香精香料 应用生物技术除可用于生产单一的香料外（如丙位癸内酯、香兰素），还可用于生产复合香料。如国内某香精香料公司研究部，以奶油为原料，运用生物酶水解和氧化热裂解组合制备天然奶香料。还有上海某香料有限公司生物部，通过脂肪酶或接入某种微生物得到酶解奶油（即天然奶香基）。再以酶解奶油为基料加以适当的修饰，根据不同需要可以调配成各种奶香精如：白脱香精、鲜奶香精、纯奶香精、奶油香精、奶酪香精等。因此酶解奶油比天然奶油的香气高出很多倍。以上工程中较少的了解多种酶的协同作用，对关键的生化反应的调控也不甚了解。虽然所制备出的香料香气浓郁、纯正、逼真，但是不够自然、平衡、和谐。用其调配出的奶香精加香于食品后，只有在头香中起作用，不能使天然奶香气自始至终 “一脉相承 ”、“贯穿到底”。这样的酶工程从本质上说与发酵工程一样仍然属于试验科学范畴，距离理性科学还有相当长的路要走。因此，我们可以尝试应用崭新生物技术来制备天然香精香料。所谓崭新生物技术就是集成于微生物生态学技术、发酵技术、酶工程、基因工程、组合生物催化和组合生物合成等技术，所用菌种为某一开花植物内生的、顶级的微生物群落。 2.1崭新生物技术制备天然奶香精 在崭新生物技术中所用菌种为某一植物内生的、顶级的微生物群落。顶级的微生物群落是成熟的、稳定的，群落的种群间的生物催化和生物合成往往是有协同效应的。因此菌种能将发酵技术、酶工程、基因工程、组合生物催化和组合生物合成等技术的天然内部联系有机地、紧密地结合起来，生产出目标产物。 天然乳汁是贮藏着丰富的香物质和香气前体物质，是许多天然食品所不具有的。当运用崭新生物技术于天然乳汁时，其过程是：第一阶段是进行缺氧发酵，根据微生物群落（菌种）特性，群落的种群会很快侵染到酪蛋白胶粒和乳脂肪球内，与它们形成短期的共生关系，并且识别、收集、整理乳汁中有关基因信息、信息分子等，在种群的协同下，为构建各种相应的酶以及代谢途径而进行基因重组；在上述基础上，进行第二次投放菌种，对重组基因进行有序表达。初步对各种脂肪、酪蛋白、乳糖进行组合生物催化以及发酵，产生出基本鲜奶、奶酪的特征风味物质，并实现了与水分的分离。第二阶段，是除出大部分水分，留下酪蛋白、脂肪类发酵（凝固）物，在无菌室内进行有氧浅盘固体发酵，其中酶工程情况如下，菌种细胞在非水相中使某些酶可以催化在原来发酵液中不能进行的反应，如脂肪酶在非水相中可以催化酯化、转酯化以及氨解等多种反应，同时抑制依赖于水的某些不利反应和副产物。由于菌种存在各种不同的种群，产生各种不同催化功能的体系，以及产生各式各样的“宿主-载体”系统的生物合成途径，从而利用组合生物催化和组合生物合成催形成大量的、丰富的香物质，并使许多香气前体物质转化为香物质，此外极可能控制底物的特异性、区域选择性和立体选择性，产生出手性香物质，特别是对乳脂肪中一些特殊脂肪（其他天然食品中没有）进行酶促反应，产生一些特殊风味的酶解物。总之，第二阶段是对第一阶段的补充，也就是补充和丰富了对整体香气起作用的许多香物质，且使整体香气更和谐、更圆和、更自然、更新鲜。对天然乳汁进行的崭新生物技术处理，所制备出的天然牛乳香精的香气：香气浓郁、纯正、逼真、新鲜，鲜奶香气自始至终“一脉相承”、“贯穿到底”。这样的香精可以作为一种高档天然食品添加剂，用于生产高档食品，如高级果糖、高档乳制品等。该工程的工艺简单，能耗低，易控制。如发酵是缺氧发酵，在发酵过程中不需要无菌空气，不需要搅拌，调控参数为温度和PH值；酶工程中调控温度在室温就行了。发酵可采用分批发酵方式，前一次的乳清材料可作为下一次发酵的部分菌种，且还含有一些有用的酶系，工艺设备相对简单，有利于工业化。其实，工业应用中最要的问题就是，在微生物技术从实验室研究到工业应用的过程是比较漫长的，这其中主要有两个科学挑战，一是通常是由一个菌株获得的研究结果，尤其是实验室的典型菌株，然而工业上需求大量的菌株、多种培养条件和培养基；二是对于遗传改良的菌株可能适用于实验室的证明，但是很少用于有目的的释放到环境中微生物或用于消费的含有活的微生物的乳制品[7]。而我们使用的是一微生物群落，能在工业规模上、标准条件下，进行自身改良，适应工业环境条件，用于有目的的释放到环境中的微生物群落。原则上一般不需要中试，因此工业应用相对更方便得多。 2.2崭新生物技术制备其他天然香精香料 其实在此之前我已做过，由上述崭新生物技术制备天然水质桂花香精，所用原料为天然新鲜桂花和水，所得发酵液呈现桂花香韵，还有以黄皮果（不含种子）和水为原料，所得发酵液呈现黄皮果独特香韵。以相同的技术可制备天然水质柑橘、菠萝、洋葱、腊梅等香精。大多数研究开发天然香料的科技人员都不敢相信这样事情。这里含有许多奥秘，有待我们去揭开。另外我们还可运用这种微生物生态学技术，以大豆、花生（经过适当预处理）为原料，生产出另一些天然香料来。我们还可以探索运用崭新生物技术，以芝麻、葵花籽，蓖麻籽、葫芦巴籽（经适当预处理）为原料，制备几种独特的天然香精香料。 3. 结论 上述我们简述了一种崭新的生物技术制备天然香精香料的生物法，它将赋予生物技术的新内涵。生物法制备天然香精香料的历史不长，而运用崭新生物技术制备天然香精香料才刚刚起步，随着对这一微生物群落的微生物学、生理学、生态学、组合生物催化和组合生物合成、技术工艺和遗传学的深入研究，逐步完善这一崭新生物技术，使该技术能制备许多新的天然香精香料产品，逐步丰富天然香精香料的品种，将它们用于食品的加香，生产出许多中、高档食品新品种，逐步满足人们对食品的各种美味的需求。因此，生物法制备天然香精香料必将有一个光明的前途。 参考文献： [1] 王淼 田亚平编著. 食品风味物质与生物技术. 北京：中国轻工业出版社，2004 [2] [美]陈洪编著. 香物质的生物法制备. 北京：中国轻工业出版社，2008 [3] 林翔云编著. 调香术. 北京：化学工业出版社，2008 [4] 姜标 汪桦，李祖义.生物催化制备香精香料。有机化学[J].2007.27（3）.377~384 [5] 张永忠 李铁晶 赵新淮 于国萍编著. 乳品化学. 北京：科学出版社，2007 [6] 陈守文主编. 酶工程. 北京：科学出版社，2008 [7] 霍贵成主编. 乳酸菌的研究与应用. 北京：中国轻工业出版社，2007 作者联系方式 姓名：苏林 地址：广西桂林 广西师范大学 本部 工作单位：广西师范大学 |
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charles917
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