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【求助/交流】随机引物和oligo dT用法
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| 如题，在做反转录时，用以上2个引物有什么不同么? |
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| Oligo dT 要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA适用。他主要适合长链甚至全长mRNA的RT，这样对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的DNA污染，RNA降解和RNA断裂（如电泳中出现多条非典型的带而又明确不是DNA带那么就要考虑RNA出现断裂的情况）其RT通常有标准浓度，比较好掌握。随机引物适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低），关于是否对具有复杂二级结构的模板有特殊的优点只能说maybe，事实上很多情况下我们是没有分析RNA的二级结构的。（我用RNAstructure分析，但是一般分析发现复杂二级结构不是想到换用随机引物，而是考虑做巢式PCR或者考虑做二步PCR，因为引物设计处有连续复杂的二级结构设计引物就会设计不出来，但是如果引物退火处后面不远就出现连续复杂的二级结构那么不用二级结构分析软件是不容易发现的而且它也会严重影响PCR扩增）事实上引物退火后面不远处如何出现严重连续二级结构是我们需要注意的，改用随机引物做RT倒是是比较好的选择，但是如果不在PCR阶段针对性的修改策略是不行的。特异性引物注意只能用你设计引物时的下游引物做RT，自己画图就明白了。适合各种RNA的RT，适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择，这样对操作者的技战术水平提出了严峻挑战。所以通常适用于引物设计和合成有保障，引物退火处之后没有复杂二级结构，目的模板丰度高（注意丰度高是指的目的gene的mRNA丰度高，与总RAN是两个概念）的情况。通常不推荐。有些试剂核诸如Qiagen的RT试剂盒很讨厌不带随机引物和Oligo dT，这时可以先用特异性引物试一试，看看情况再说，做不出来也不要紧，这不是RT的最佳选择，只是不用多花钱的妥协选择而已^_^。至于其合成的cDNA更为特异从而以后PCR更为特异的说法虽然有一定的道理，但是纯属于理论性质的，不能作为选择他的原因。通常加入某个引物（模板其实没有这个序列）RT，然后用这个引物扩增还是可以得到很多非特异扩增产物的，只是片断一般不超过400bp。所以使用特异性引物特异性更高的说法不能全信，尤其是扩增片断比较短的时候（小于400bp）。因为很少有RT酶可以在退火温度反应而不失活的。除非少数耐热的很贵的RT酶 |
2楼2009-12-23 10:17:43