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汕头大学海洋科学接受调剂
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十年一剑888

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR问题[已解决]

我做的是真菌,引物为ITS5和ITS4 ,提取的DNA条带清晰,杂质非常少。
但是PCR不出条带,奇怪的是:我设的阴性对照却出了个非常清晰的条带,500bp与750bp之间。反复做了好几次,都是这个结果!有同学这是引物二聚体,有些同学说不会是引物二聚体,引物二聚体不会这么大。
请问,这是什么原因造成的?

[ Last edited by 十年一剑888 on 2010-1-7 at 12:05 ]
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695

木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★ ★
十年一剑888(金币+5,VIP+0): 12-22 16:54
这个要是查找原因,的确很是费劲,建议还是重新换试剂吧。我这里说我一个例子,我当时用质粒做PCR,当时也有过阴性出带的问题,而且我的质粒出带不是特异带,还有多余的共有带,当时也是换试剂可折腾了,但是后来发现是引物与我的未知模板有匹配的原因,仅供参考,后来一切都游刃有余了了,祝顺利!
4楼2009-12-22 16:28:25
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★
十年一剑888(金币+5,VIP+0): 12-22 16:54
可以确定不是二聚体,阴性对照出带,应该是污染啊,你说的引物,对我们没有任何价值,你可以说一下你的阴性对照是什么,你要扩增的是什么
2楼2009-12-22 15:33:26
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十年一剑888

金虫 (小有名气)

我想扩增出真菌ITS区序列,然后回收测序。
最有可能的是哪个环节污染呢?
3楼2009-12-22 15:54:13
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-22 19:11
我觉得可能是引物设计的不好,但楼主P出的肯定不是引物二聚体。我以前也出现过阴性对照不加模板但是能P出条带的情况,具体的原因没有分析出来,建议重新设计引物试试。
5楼2009-12-22 17:50:57
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