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472514568

至尊木虫 (职业作家)

小木虫议政大臣兼协办大学士

[交流] 【求助/交流】目的基因和载体的连接

打算将一个具有KpnI末端的DNA片段克隆到具有BamH I末端的载体中。但问题是  两个酶切的末端不匹配 (BamH I的末端是5‘端突出,而KpnI的末端是3’端突出)。
请问各位怎样修饰才能将目的片断连接到载体上?
(如方法越多越好)要求利用基因工程上的各种工具酶来修饰

[ Last edited by 472514568 on 2009-12-19 at 14:35 ]
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保持心灵的纯洁
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人


472514568(金币+1,VIP+0):方法可以,但是要求用基因工程上各种工具酶进行修饰 12-19 14:34
啥时候的贴?

想一个最笨的办法
重新设计个BamH I的引物,扩出来,在切,在去连
小木虫之有关部门负责人
2楼2009-12-19 14:24:19
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

先PCR再切
3楼2009-12-19 18:40:07
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472514568

至尊木虫 (职业作家)

小木虫议政大臣兼协办大学士

引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 12/19/09 18:40:
先PCR再切

能说详细点吗?
保持心灵的纯洁
4楼2009-12-19 18:56:26
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★
472514568(金币+4,VIP+0):非常感谢! 12-20 11:13
1、klenow酶将粘性末端切平后平端连接
2、将粘性末端补齐后连接
5楼2009-12-20 01:56:19
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rainbamboo8707

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
472514568(金币+4,VIP+0):谢谢回帖! 12-20 19:31
用T4 DNA Polymerase将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平,然后按平末端进行连接。T4 DNA Polymerase的3'→5'外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。
6楼2009-12-20 12:29:32
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