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雅克梅林

铜虫 (小有名气)

[交流] 微生物方面的问题

细菌菌体含氮量的测定方法  最好详细点哈
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1楼2009-12-16 16:54:02
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ztjnanning

木虫 (职业作家)
样品中总氮量的测定——微量凯氏定氮法

实验原理
1.什么是凯氏定氮法？有什么意义？
大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为16％，即每100g蛋白质中含16g氮，因此可通过测定生物样品中的氮来测定蛋白质的含量（每测得1g氮即相当于6.25g蛋白质）。这是定氮法测定蛋白质含量的计算基础，即用定氮法测得的样品含氮量乘以6.25，即可算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量＝含氮量×6.25，测定蛋白质含量的方法很多，其中最基本和常用的方法就是测定含氮量的方法。测定含氮量一般都采用微量凯氏定氮法。
2.该方法原理？
蛋白质样品先经浓硫酸加热消化，使蛋白质中的有机氮转变成为无机氮，然后经碱化蒸馏，放出的氨气用标准酸吸收，再用标准碱来滴定剩余的酸，计算出的含氮量乘以6.25即是该样品中的蛋白质含量。
材料、仪器与试剂
（一）实验材料：市售面粉
（二）仪器设备 （仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）
凯氏烧瓶；凯氏定氮蒸馏装置；容量瓶；微量滴定管；烘箱；电炉；1000毫升蒸馏烧瓶；小玻璃珠或毛细管；电子天平。
（三）试剂 （试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）
浓硫酸（AR）；硫酸铜；硫酸钾混；甲基红乙醇；溴甲酚绿乙醇；棚酸；乙醇；氢氧化钠；
实验操作：
1．凯氏定氮仪的构造和安装：
凯氏定氮仪主要由蒸汽发生器，反应管及冷凝器三部分组成：
蒸汽发生器包括电炉及一个1~2升容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应管相连，反应管上端有一个小漏斗，样品和碱液可由此加入到反应室，反应室中心有一长玻璃管，与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。反应产生的氨可通过反应室上安全管及冷凝器通过吸收瓶中。安装时各连接处不能漏气，且安装好的不可轻易移动，以免仪器损坏。
2．样品处理：
某一固体样品中的含氮量是用100克该物质（干重）中所含氮的克数来表示（%）。因此在定氮前，应先将固体样品中的水份除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水，都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称量，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。
精确称取0.1克左右的干燥面粉作为实验的样品。
3．消化：
取四个100ml凯氏烧瓶并标号。各加1颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1克，催化剂200毫克，浓硫酸5毫升，注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0.1毫升蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。加完后，将这四个烧瓶放在通风橱内的电炉上消化。
在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止①。消化完毕，等烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10毫升（注意慢加，随加随摇）。冷却后将瓶中内容物倾入50毫升的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入溶量瓶。用水稀释到刻度，混匀备用②。
4．蒸馏：
（1）蒸馏器的洗涤：在蒸汽发生瓶中加入三分之二体积的蒸馏水，加浓硫酸数滴及毛细管或玻珠若干，关闭甲乙，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。并检查有无漏气，5分钟后，打开活塞乙，使蒸汽洗涤漏斗5分钟，复将乙关闭，继续蒸馏约5分钟，然后在冷凝器下端放一个盛有5毫升2%硼酸溶液和1—2滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜如图，冷凝器下端应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤1—2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1厘米，继续通蒸汽1分钟，最后用水冲洗冷凝管口。然后移去或关掉电炉，由于蒸汽发生器内蒸气冷缩，压力减低，反应室内的水可自动吸出进入废液管中（图中3），打开甲，将废液排出。
（2）蒸馏：取50毫升锥形瓶数个，各加5毫升硼酸和1—2滴指示剂，溶液呈紫红色，用表面皿覆盖备用。关掉电炉，打开活塞甲、乙，再将事先准备好的盛有5ml2%硼酸及指示剂的锥形瓶放在冷凝管中下，使管口浸入液面以下。用吸管取10ml消化液，细心地由小漏斗处注入反应室，用2—3ml蒸馏水洗涤小漏斗，待消化液全部进入反应室后关闭活塞甲。然后再由小漏斗处加30%NaOH10ml（用小量筒量取），让NaOH缓缓流入反应室，当小漏斗内仍有少量NaOH时，即关闭乙，再用约3ml蒸馏水于小漏斗内，同样放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封，关闭乙，立即加热蒸汽发生器，并使沸腾，开始蒸馏。待三角烧瓶中液体由紫红色变成蓝绿色时再继续蒸馏3分钟，将三角烧瓶下降，使冷凝管口离开液面约1cm，继续蒸1分钟，用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，洗液直接流入锥开瓶内，然后，先移去锥形瓶，关掉电炉，使反应室内废液倒吸进入废液管内，打开甲而放出。整个蒸馏装置立即洗涤（包括水洗及蒸汽洗）备用。待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。
（3）滴定：全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示溶液由蓝绿变淡紫红色为滴定终点。
结果与讨论：
1．计算：
总氮量=           ×               ×%
C：标准盐酸溶液摩尔浓度。
V1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。
V2：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。
W：样品重量（克）。
14：氮的原子量。
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25，若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸的样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而教育处出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。
           蛋白氮=总氮—非蛋白氮
           蛋白质含量（克%）=蛋白氮×6.25
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4楼2009-12-16 21:21:32
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zq20051215

木虫 (正式写手)
要研究微生物生长的过程，需要做定量测定，否则就没有量的概念。我们通常是测定群体生长的量，而不是只测一个细胞的生长。因为这样做一方面感到比较困难，另一方面其实用价值也不大。目前测定微生物群体生长 的方法不外乎两大类：一类是测定细胞物质量的增加，一类是测定细胞数 目的增加。
一、细胞量的测定
    常用的细胞量测定法有下列3种：
1、干重法
该方法是将单位体积培养液中的菌体用清水洗净，然后放人干燥器 内加热或减压干燥，最后再用精密仪器测定其干重。一般说来，干重为湿重的20%—25% ，即1mg干菌=4—5mg ，湿菌=（4—5）*109个菌体。
2、氮量法
微生物细胞的含氮量一般 比较稳定，所 以常作为生长量的指标，如细菌含氮量一般约为菌体干重的14% 。利用微量定氮法测定细菌含氮总量，可换算出整个菌体的干重。
3、浑浊度法
   此法为最常用的细胞测定法。这一方法的依据是：在一定范围内，小颗粒散射的光量与浓度成正比。光束穿过细菌悬浮液，通过的光量 由于散射而减少，因而可以作细胞密度测定。这种测定通常采用光电比色计或分光光度计进行。为提高本法的灵敏度，一是要使用短波光，二是要细菌浓度超过107个/ml。该方法要和标准 曲线结合运用才有意义。
    另外，还有测定耗氧量或其他代谢产物来作为细胞量指标的。
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2楼2009-12-16 17:00:48
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ztjnanning

木虫 (职业作家)
菌體重量測定：

菌體乾重：將檢體過濾後乾燥稱其乾重。

氮量測定：測定菌體之氮量換算菌量。

混?岫确ǎ壕鷶翟蕉嗷�?岫仍礁哂苫�?岫韧乒谰俊�

氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。

方法是，离心取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02N的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。
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3楼2009-12-16 21:11:26
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