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qiusuo铁杆木虫 (著名写手)
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快速叶绿素荧光诱导动力学分析在光合作用研究中的应用
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光合作用是植物和光合细菌将光能转化为化学能的过程。天线色素分子吸收的光能主要用于反应中心的光化学反应，而过量的激发能则以热耗散等方式耗散掉 (Krause 和 Weis 1991)。色素分子的荧光发射除了受到激发能的传递、天线色素和反应中心色素的性质和定位的影响外，还受反应中心的氧化还原状态及光系统 Ⅱ(PSⅡ) 反应中心供体侧和受体侧氧化还原状态的影响 (Krause 和 Weis 1991；Maxwell 和 Johnson 2000)。 Kautsky 和 Hirsh(1931) 最先认识到光合原初反应和叶绿素荧光存在着密切关系。他们第一次报告了经过暗适应的光合材料照光后，叶绿素荧光先迅速上升到一个最大值，然后逐渐下降，最后达到一个稳定值。此后，随着研究的深入，人们逐步认识到荧光诱导动力学曲线中蕴藏着丰富的信息。近年来快速叶绿素荧光诱导动力学的应用，使 PSⅡ 供体侧和受体侧电子传递的研究更加深入 (Strasser 和 Govindjee 1991，1992；Govindjee 1995；Strasser 等1995，2000，2004)。Strasser 和 Strasser (1995)在生物膜能量流动 (Strasser 1981) 基础上建立了针对快速叶绿素荧光诱导曲线的数据分析和处理方法——JIP-测定 (JIP-test)，为深入研究光合作用原初反应提供了有力而便捷的工具。本文结合作者的研究结果，简要介绍 JIP-测定的原理及其应用。 1 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的定义及测定 1.1 定义 将暗适应的绿色植物或含有叶绿素的部分组织突然暴露在可见光下之后就会观察到，植物绿色组织发出一种强度不断变化的暗红色荧光，荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。这一现象最早是由 Kautsky 发现的，因此也称为 Kautsky 效应。植物发出的荧光强度随时间而变化，在从暗适应到暴露在光下时，荧光强度先上升，然后下降。一般情况下，刚暴露在光下时的最低荧光定义为 O 点，荧光的最高峰定义为 P 点，快速叶绿素荧光诱导动力学曲线指的就是从 O 点到 P 点的荧光变化过程 (图1)，主要反映了 PSⅡ 的原初光化学反应及光合机构的结构和状态等的变化 (Krause 和 Weis 1991；Strasser 等1995，2000，2004)，而下降的阶段主要反映了光合碳代谢的变化，随着光合碳代谢速率的上升，荧光强度逐渐下降 (Krause 和 Weis 1991)。 1.2 测定 叶绿素荧光诱导动力学曲线的测定可采用调制脉冲式和连续激发式(非调制式)两种不同的荧光仪，它们各有不同的特点。 由于调制式荧光仪用来测量荧光的光源是调制脉冲光(高频率的闪光)，植物发出的荧光信号与背景光可以区分开，所以用它可以在有背景光的情况下测定。常用的调制式荧光仪的测量步骤是，先打开测量光 (measuring light)，测暗适应叶片的最小荧光 (Fo)，然后打开饱和脉冲光 (saturating flash light) 测暗适应叶片的最大荧光(Fm)，然后再开启作用光 (actinic light) 使所测材料进行光合作用。当所测材料光合作用达到稳态后测稳态荧光 (Fs)，然后打开饱和脉冲光测光适应后的最大荧光 (Fm')，关掉作用光，打开远红光 (farred light) 优先激发 PSⅠ 使 PSⅡ 电子传递体处于氧化状态，测定光适应叶片的最小荧光 (Fo')。根据这些参数可以计算暗适应下 PSⅡ 的最大量子产额 [Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm]、光适应下 PSⅡ 的最大量子产额[Fv'/Fm'=(Fm'-Fo')/Fm']、光适应下的 PSⅡ 反应中心开放的比例[qp=(Fm'-Fs)/(Fo'-Fm')]、光适应下 PSⅡ 的实际光化学效率 [φPSⅡ=(Fm'-Fs)/Fm'] (Genty 等1989) 和光适应下的非光化学猝灭 (NPQ=Fm/Fm'-1) (Demmig-Adams 和 Adams 1996) 等。除了 Fv/Fm反映了荧光诱导动力学曲线上升过程的 O-P 段外，其它参数都是反映 P 点之后的下降过程。由于光合作用的碳同化反应能反馈影响光合原初反应，调制式荧光仪主要通过测量光合作用的原初光化学反应的情况来探测光合作用的碳同化等反应启动后的光能捕获、转化及利用情况。而对于碳同化反应活化前 PSⅡ 的光化学变化，所获得的信息就很少了。由于时间分辨率及信噪比的限制，对于从 O-P 上升过程中荧光变化的信息量的获得，与连续激发式荧光仪相比，调制式荧光仪远不及前者。 连续激发式荧光仪 (PEA 或 Handy PEA，Hansatech，英国) 主要是通过短时间照光后荧光信号的瞬时变化反映暗反应活化前 PSⅡ 的光化学变化，它具有相当高的分辨率(初始记录速度为每秒钟10万次，即100 kHz)，所以能够从 O-P 上升过程中捕捉到更多的荧光变化信息，如 O-P 变化过程中的另外两个拐点 (J 点和 I 点)。从照光后的10 μs 到5 min 内不同时间的荧光信号都能被 Handy-PEA 按时记录。在对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线作图时，为了更好地观察 J 点和 I 点，一般把代表时间的横坐标改为对数坐标，结果得到 0-J-I-P 诱导曲线 (图1B)。与调制式荧光仪相比，连续激发式荧光仪有以下优点：获得信息量大、操作简便快捷、测定易于多次重复、仪器便于携带、存储量大、价格低廉。下面就 O-J-I-P 快速荧光诱导动力学曲线及 JIP-测定做具体介绍。 2 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的意义 2.1 特征位点 典型的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线有O、J、I、P 等相 (Strasser 和 Govindjee 1991，1992；Strasser 等1995，2000，2004)(图1B)。植物的光合机构包括光系统Ⅱ (PSⅡ) 和光系统Ⅰ(PSⅠ)，植物被照光后，PSⅡ 的捕光色素将捕获的光量子传递给反应中心 (P680)，使 P680 受激发处于第一激发单线态 (P680*)，P680* 很不稳定，将受激发产生的电子传递给 P680 受体侧的去镁叶绿素 (Pheo)，生成P680+Pheo-，然后 Pheo- 将电子传递给 PSⅡ 的电子受体：初级醌受体 (QA)、次级醌受体 (QB) 及质体醌 (PQ) 等，最后经质兰素 (PC) 传递到 PSⅠ 的反应中心 (P700)，生成的 P680+ 可以从 P680 的供体侧夺取电子，并最终导致 H2O 的裂解。与 P680 一样，P700受光激发后，生成 P700*，P700* 将受激发产生的电子传递给铁氧还蛋白，生成 P700+，并最终由铁氧还蛋白-NADP+ 还原酶把 NADP+ 还原为 NADPH，用于光合碳的还原，P700+ 又可以接受从 PSⅡ 传来的电子，形成可持续的电子传递。电子传递的过程伴随着质子的传递和跨膜质子梯度的生成，并最终偶联 ATP 的生成。在光合机构捕获光能发生电子传递的同时，还有一部分能量以热和荧光的形式耗散掉。这三者之间是互相竞争的关系，任何一者的改变都会导致其它二者发生变化。例如，如果电子传递受阻，荧光和热耗散就会上升。植物绿色器官在经充分暗适应后，PSⅡ 的电子受体：QA、QR 及 PQ 等均完全失去电子而被氧化 (Krause 和 Weis 1991；Strasser 等1995)。这时 PSⅡ的受体侧接受电子的能力最大，PSⅡ 反应中心可最大限度地接受光量子，即处于“完全开放”状态，此时样品受光后发射的荧光最小，处于初始相“O” (Fo)。当对样品照以强光时，PSⅡ 反应中心被激发后产生的电子经由 Pheo 传给 QA，将其还原，生成 QA-。此时，由于 QB 不能及时从 A-接受电子将它氧化 [P680*→Pheo- 需要 3 ps，Pheo- →QA 需要250～300 ps，而 QA-→QB 需要100～200 μs (Krause 和 Weis 1991)]，造成 QA- 的大量积累，荧光迅速上升至 J 点 (Govi-ndjee 1995；Strasser 等1995，2000，2004)。QB 能够从 QA- 接受电子，形成 QB2- ，导致 QA 和 Pheo 完全进入还原状态。此时 PSⅡ 反应中心完全关闭，不再接受光量子，荧光产量最高，出现 P 点。在电子从 QA-，向 QB 传递过程中出现的 I 点(图1 B)反映了 PQ 库的异质性(Strasser 等1995；Govindjee 1995)，即电子传递过程中快还原型 PQ 库先被完全还原 (J-I)，随后才是慢还原型 PQ 库被还原 (I-P)。但是，也有学者不认同这种观点，而且目前对于 I-P 荧光上升的过程还存在其它一些解释，所以 I 点出现的原因需要进一步研究。 2.2 JIP-测定的参数 植物快速叶绿素荧光诱导曲线中包含着大量关于 PSⅡ 反应中心原初光化学反应的信息，通过对曲线荧光参数(表1)的分析，可以知道在环境因子影响下植物材料光合机构的变化。从动力学曲线上可以得到大量的原始数据，为了能更好地反映动力学曲线和被测样品材料的关系，Strasser 和Strasser (1995)以生物膜能量流动为基础，通过计算能量流和能量比率来衡量在给定物理状态下样品材料内部变化，建立了高度简化的能量流动模型图 (图2)。依照能量流动模型，天线色素 (Ch1) 吸收的能量 (ABS) 的一部分以热能和荧光 (F) 的形式耗散掉，另一部分则被反应中心 (RC，在 JIP-测定中 RC 指有活性的反应中心) 所捕获 (TR)，在反应中心激发能被转化为还原能，将 QA 还原为 QA-，后者又可以被重新氧化，从而产生电子传递 (electron transport，ET)，把传递的电子用于固定 CO2，或其它途径。在此基础上发展起来的数据处理(表1)称为“JIP-测定” (Strasser 和 Strasser 1995；Kruger 等1997；Strasser 等2000，2004)。JIP-测定为我们提供了被测样品材料的大量信息，如光合器官在不同环境条件下的结构和功能的变化 (Strivastava 和 Strasser 1996；Jiang 等2003；Hermans 等2003；van Heerden 等2003，2004)。 在快速叶绿素荧光诱导动力学曲线参数中，VJ 反映了照光2 ms 时有活性的反应中心的关闭程度；Mo 反映了 QA 被还原的最大速率，即 O-J 过程中 QA 被还原的速率 (Strasser 和 Strasser 1995；Strasser 等2000，2004)，它与反应中心色素、捕光色素和 QA 所处的状态有关；Sm 反映了使 QA 完全被还原所需要的能量，即 PSⅡ 反应中心受体侧 PQ 库的大小，电子从 QA- 进入电子传递链越多，则到达 Fm 所需要的时间就越长，Sm 的值也越大。叶片在受到光破坏时，D1 蛋白降解加剧，结果使电子传递体，特别是 QB 易从蛋白复合体上脱落下来，造成受体库容量的减小，表现为 Sm 减小 (Strasser等1997)。 ΦPo 反映了暗适应后的最大光化学效率，其意义与调制脉冲式荧光仪测定的参数 Fv/Fm 相同；ψo 反映了在反应中心捕获的激子中(激子是指由高能电子激发的量子，它能转移能量但不能转移电荷)，用来推动电子传递到电子传递链中超过 QA 的其它电子受体的激子占用来推动 QA 还原激子的比率，即照光2 ms 时有活性的反应中心的开放程度；ΦEo 反映了反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额，即反应中心吸收的光能将电子传递到电子传递链中超过 QA 的其它电子受体的概率。而且，通过 JIP-测定还可以分析光合机构的比活性，即活跃的单位反应中心 (RC) 或单位受光面积 (CS) 的各种量子效率 (ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC、DIo/RC、ABS/CS、TRo/CS、ETo/CS、DIo/CS 等，表1)以及单位面积上的反应中心的数量 (RC/CS)。比活性可以更确切地反映植物的光合器官对光能的吸收、转化和耗散等状况。性能指数 (PIABS、PICS) 包含了3个参数 [RC/ABS (或 RC/CS )、ΦPo 和 ψo ]，这3个参数相互独立，所以性能指数和推动力可以更准确地反映植物光合机构的状态，它们对某些胁迫比 FV/Fm 更敏感，能更好地反映胁迫对光合机构的影响 (Appenroth 等2001；van Heerden 等2003，2004)。 3 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线在光合作用研究中的应用 植物本身的生理变化如衰老 (Lu 和 Zhang 1998a；Dai 等2004)，或者逆境胁迫如缺铁或锰饥饿 (Jiang 等2001，2002，2003)、高温 (Guissé等1995；Lu 和 Zhang 1999；Chen 等2004a)、低温 (Fryer 等1998)、盐胁迫 (Lu 等2003a，b；Chen 等2004b)及干旱 (Eggenberg 等1995；Lu 和 Zhang 1998b)等都能够直接或间接地影响植物 PSⅡ 的功能。当环境条件变化时，叶绿素荧光的变化可以在一定程度上反映环境因子对植物的影响 (Krause 和 Weis 1991；Maxwell 和 Johnson 2000；Jiang 等2003)，通过对不同环境条件下快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的分析，可深入了解以上这些因素对植物光合机构主要是 PSⅡ 的影响以及光合机构对环境的适应机制。 3.1 分析 PSⅡ 供体侧的变化 当 PSⅡ 的供体侧受到伤害时，经过极短的时间(在 J 点之前)，叶绿素荧光强度就会上升，出现 K 点(照光后大约300 μs 处的特征位点)，多相荧光 O-J-I-P 变为 O-K-J-I-P (Guissé 等1995；Strivastava 和 Strasser 1996；SRIvastava 等1997；Chen 等2004b)，甚至有更多的拐点出现，变为 O-L-K-J-I-H-G-P (Strasser 等2004)。如高温胁迫导致 K 点 (300 μs) 出现，K 点的出现是由于水裂解系统被抑制和 QA 之前受体侧的部分被抑制所造成的 (Guissé 等1995；Strasser 等2000，2004)。在此抑制过程中，受伤害的是放氧复合体 (OEC)，所以 K 点可以作为 OEC 受伤害的一个特殊标记 (Eggenberg 等1995：Strasser 等2000，2004)。小麦经过热处理 (25℃～45 ℃)后出现明显的 K 点，这说明高温伤害了 OEC (Lu 和 Zhang 1999)。Lu 等(2003b)的研究结果表明，盐适应增强了植物耐高温的能力，高温处理后荧光诱导曲线上表现为 K 点的荧光产量增加减缓。而且当水与 PSⅡ 之间的电子传递受阻时，荧光上升变慢且荧光强度变小 (Critchley 等1982)。我们的结果表明，高温胁迫及缺铁都能够导致 K 点的出现 (Jiang 等2003；Chen 等2004b)。此外，某些重金属的盐，如铬酸盐也能诱导 K 点的出现 (Susplugas 等2000；Appenroth 等2001)。而且，通过 JIP-测定数据处理方法，通过比较 K 点荧光强度的大小，可以计算出放氧复合体被破坏的程度 (Lu 和 Zhang 1999；Appenroth 等2001；Chen 等2004a)。 3.2 分析 PSⅡ 受体侧的变化 Mo、Sm、ΦEo、ψo 等参数主要反映了 PSⅡ 受体侧的变化。PSⅡ 受体侧主要包括 QA、QB 和 PQ 库等。当用 DCMU 处理植物材料时，由于 DCMU 能抑制从 QA- 往下的电子传递，所以此时 QA 被还原得最快，Mo 最大 (Strasser 和 Strasser 1995)。通过测量 Sm、ΦEo、ψo 等参数，证明了 QA- 后面的电子传递链对铬酸盐高度敏感 (APPenroth 等 2001)。低温胁迫也导致 ΦEo、ψo 下降 (van Heerden 等2003)。我们的结果表明，与功能叶相比，杂交酸模衰老叶片 PSⅡ 受体侧的电子受体库容量 (Sm) 变小，从而导致电子传递到电子传递链中超过 QA- 的电子受体的概率 (ΦEo) 下降，较多的光能用来还原 QA，使 QA 的还原 (Mo) 加速(结果未列出)。 3.3 分析 PSⅡ 反应中心的变化 在正常条件下，有活性的 PSⅡ 反应中心将捕获的光能用于光化学反应，通过电子传递和耦联的光合磷酸化形成同化力，推动碳同化反应。然而，在某些胁迫下，PSⅡ 反应中心发生可逆失活，成为一个能量陷阱，能吸收光能但不能推动电子传递。一旦逆境解除，失活的反应中心又恢复活性。研究表明，这种反应中心失活可能也是一种保护机制 (Lee 等2001；Strasser 等2004)。用连续激发式荧光仪 (Handy-PEA) 可以非常方便地测量出失活反应中心的比例，如非 QA 还原 (non-QA-reducing) 反应中心和非 QB 还原 (non-QB-reducing) 反应中心的比例 (Appenroth 等2001；Strasser 等2004)。非 QA 还原反应中心是指既不还原 QA 也不把激发能传回天线色素的反应中心；非 QB 还原反应中心是指反应中心结合 QA 但不结合 QB，因此反应中心将电子传递到 QA 就不再往下传递。研究表明，铬酸盐胁迫使非 QB 还原反应中心的比例增加 (Appenroth 等2001)。通过 JIP-测定分析，可以知道胁迫对植物有活性的反应中心的影响。当然这些参数在某种意义上也反映了 PSⅡ 供体侧和受体侧的变化。我们的研究表明，随着叶片的展开，非 QA 还原反应中心和非 QB 还原反应中心比例下降(结果未列出)，表明随着植物叶片的展开，植物叶片的光合机构、光合能力逐渐形成，这也与我们在大豆叶片展开过程中光合能力逐渐形成的研究结果相一致 (Jiang 等2004)。 4 在其它研究领域的应用 随着光合理论的发展，叶绿素荧光动力学特别是快速叶绿素荧光诱导动力学分析技术日趋完善。由于具有快速和非破坏性的优点，该技术方法不仅在植物生理研究中被广泛应用，而且深入到许多其它领域，如遗传育种 (MaldonadO-Rodriguez 等2003)、病虫害防治 (Bueno 等2004)及污染检测 (Appenroth 等2001；Hermans 等2003)等。有理由相信，快速叶绿素荧光诱导动力学分析技术将会在更多研究领域中得到更广泛的应用。 |
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