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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何大批量培养蓝藻
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liusong119323

木虫 (小有名气)

[交流] 如何大批量培养蓝藻

请教：如何大量培养蓝藻。主要是试验装置，配方以明确。

本帖关键词：蓝藻 配方 试验装置 培养 请教
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1楼2009-12-03 15:32:04
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qingfengwu

金虫 (小有名气)
★ ★
liusong119323(金币+2,VIP+0):谢谢 12-3 16:37
培养利用
　　约有150多种蓝藻(大多数为念珠藻目的种类)能固定大气中的分子态氮成为结合态氮,并进一步合成蛋白质。其胞外有丰富的多糖类胶质，并含生长刺激物质，适于作稻田肥料，改良土壤，提高土壤保肥、保水能力。这些蓝藻称为固氮蓝藻。在热带、亚热带地区，固氮蓝藻在每公顷稻田中每年能固氮1～70千克。
　　中国已筛选出固氮蓝藻藻种并创立了人工繁殖技术。其方法是先在实验室内培养原种，然后接种到水深3～5厘米的育藻池──土池或塑料薄膜池中扩大培养。池上加小拱薄膜覆盖以控温防雨。藻长满水面即及时捞取晒干贮存备用，或接种到空闲茬口田、杂交水稻制种田扩大生产藻种。收获的藻种可晒干或以鲜藻接种到刚插秧的晚稻田中繁殖，作为本田块的肥料。亦可捞取部分鲜藻接到其他田中繁殖或晒干备明年应用。此外，利用固氮蓝藻所含生长刺激物质处理作物的种子或秧苗，可获得壮秧和根系发达的植株。
　　蓝藻含有较高的蛋白质（一般为20～50％）、较完备的氨基酸和多种维生素。有些蓝藻可作为食品，如发菜(Nostoc flagelliforme，产中国西北干旱地区)、葛仙米（N.sphaeroides,产华中、华南山区稻田和湿地）、地木耳等。螺旋藻（Spirulina platensis）粗蛋白含量可达70％，为乍得和墨西哥的传统食品，近年来已人工培养作为商品，用作养鱼饲料。中国繁殖螺旋鱼腥藻(Anabaena spiroides)作为鱼种饵料效果良好，有些鱼类如非鲫等的成鱼也以蓝藻作为饵料。
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2楼2009-12-03 15:56:32
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qingfengwu

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
liusong119323(金币+20,VIP+0):很详细，谢谢。 12-3 16:37
一、 藻种的两种培养类型
一般来说藻种的培养有两种方式：一种是长期保存所需要的培养方法，一种是以实验为目的，短期内保藏藻种的培养方法。
长期培养最主要的问题是选择一种合适的培养基，可以在3个月到一年的时间内连续培养藻种。最适合长期培养藻种的培养基是agar（固体琼脂培养基），但是使用agar有一个弊端，即培养物保持无菌的问题；我们可以加一层蒸馏水（咸水的藻类可以加灭菌过人工的海水）在agar上，这种做法可以保证在长期保种的过程中减少agar水分和营养的流失。长期保种使用的培养基，不要选择营养过于丰富的，因为多数的藻，尤其是丝状藻，在营养丰富的环境生长，会发生形态结构上的变化，如果要做生理生态方面研究，实验材料的形态结构是不能异常的。
适合长期保种的贫营养的培养基有这些：Bold’s基础培养基，以及该培养基加上蛋白胨或者琼脂制成的agar，适合长期培养绿藻；Allen及其改良后的配方可以长期培养一般常见的蓝藻和绿藻；土水培养基和它的一个改良的系列也实用培养多数藻种。对于我库提供的藻种，由于藻种长期习惯的原因，建议使用我们提供的原配方来培养，在长期培养的时候，可以适当稀释原培养基，在藻种培养过程中，生长速率会变慢，可以保持其形态结构不变。
另外，长期培养的时候，除了选择适当的培养基，还可以降低温度5～8C（降温的过程最好能循序渐进，突然改变环境温度，可能会导致藻种不适应而死亡）。光照强度可以减小为原先的一半。在实验之前3到4周，将长期培养的藻种接种到我们提供的培养基中（培养基必须灭菌），按照我们给予的培养条件培养，在实验前6天左右，再次接种。
    短期培养则可以直接按照我们提供的培养基和培养条件培养。由于试验的需要，常常要求在短期时间内获得大量的培养物，我们可以采用通气培养和摇床培养。通气培养可以通CO2或洁净的空气，视培养物的多少来决定通气泵的大小，在通气的硅胶管中设置一个缓冲瓶，塞上灭菌后的脱脂棉，帮助净化空气，如果对通气有更高的要求，可以在通气管中加上一层滤膜。使用摇床培养，需要注意藻种的生理周期。

二、 培养基的选择和配制
1、培养基的选择
①  BG11是我库培养蓝藻使用最广泛的培养基。除了极少部分蓝藻，大部分都使用BG11。按照我们给的配方配制好后高压灭菌，BG11经常会产生絮状沉淀。这是因为其中有Ca+和CO32???-,我们可以在灭菌后再超净台上用灭菌过的注射器来加两者之中的另外一种。通常我们建议将氯化钙的母液单独灭菌后在无菌室保存，在配置好BG11的工作液并灭菌之后，在超净台上用注射器将氯华钙加入。
② SE是我库用来培养常见的绿藻所使用的培养基。一般来说，如果配制了母液，用母液来配培养基，灭菌后是不会产生沉淀的。配置的时候注意先将所需要的蒸馏水准备好，将需要的药品逐个加入，等到一种药品充分溶解之后再加入第二种。另外，土水在蒸馏过滤后，是不需要灭菌的，因为高压灭菌的过程会让其中的一些营养成分损失。
③ 水是培养基成分中很重要的一个方面。配培养基，可以取蒸馏水、自来水、去离子水，也可以取藻种采集地的水。使用经过处理的水，如双蒸水、去离子水，有时候并不合适培养，因为仪器在处理过程中会带入微量的有毒物质。采集藻种采集地的水来培养是最理想的，但是需要经过一些处理，处理的手段和过程要尽可能保持其营养成分不变。如果是咸水或者海水的藻类采集地采集的水，应将其置于5C的黑暗中，保持6个月。如果是泉水或者湖水等淡水的水源，水样置于20C的室温，立即通过活性炭方法处理：每升水加2g活性炭，搅拌一小时后，过滤，并重复此过程3～4次。
④ 咸水和微咸水的藻类需要的人工咸水的合成效果关键在于如何蒸馏；还有一些水华蓝藻难以培养，主要原因是因为在野外生长时，通常底泥提供的营养元素可以溶在水中，但是在实验室培养，经过高压灭菌，很多营养都损失了。所以我们建议不用高压灭菌法，使用巴斯德（pasteur）灭菌方法：加热到73～78C，保持15～20分钟，间隔24小时灭菌一次，一共三次。
2、培养基的配制
主要介绍一下培养基的配制方法和灭菌方法：
1. 配制贮液。
培养基一般由三个方面组成：微量元素、大量元素、维生素。
准备100ml～200ml的试剂瓶若干，洗净，灭菌。
按照我们提供的培养基配方中贮液的浓度，配制大量元素和微量元素的贮液放在以上准备的试剂瓶（遇光易反应的药品，请放在棕色试剂瓶），置于4C左右的冰箱保存。将需要使用的维生素（最好是针剂），也置于4C左右的冰箱保存。
2. 配制培养基。
一般可以配制1000ml左右的培养基留待使用。先准备1000ml大烧杯，洗净。按照我们培养基配方中的working solution，先加入需要的蒸馏水，然后用移液管向其中加配制好的贮液（注意，不可先加贮液，最后加蒸馏水）。一边加，一边搅拌，依次加入所有组分，最后留下维生素不加。摇匀。

三、 灭菌
①、 对培养器材的灭菌：
灭菌在藻种的培养中，是十分重要的一个环节。藻种培养、转接、培养基制备等等，任何一个环节都必须使用灭菌的器械，否则藻种都会染菌，甚至染上其它的藻类。
所有的培养藻种所需要的三角瓶、试管，烧杯，接种环，吸管，注射器，针头等培养，转接藻种所需要的器材都必须经过高压灭菌，配制培养基所需要的移液管、用来装培养基所需要的瓶也必须经过灭菌，转接藻种需要的滴管、接种环、涂布所需要的玻璃棒、培养皿等都必须灭菌。
培养所需要的三角瓶、试管、培养皿，灭菌前洗净，三角瓶可以用牛皮纸内衬粗滤纸来包住瓶口，用棉线缠紧；或者自做棉塞，外部再加上牛皮纸包住；试管必须和棉塞或者试管塞一起用牛皮纸包好灭菌。培养皿可以5～10个一起用牛皮纸包好灭菌。移液管、滴管、接种环都可以分别用牛皮纸包好灭菌。所有玻璃器皿都采用高压灭菌：在1.5大气压下保持30分钟。使用之前不能在敞开的环境打开，只能在超净台打开。
灭菌结束后，放在烤箱烘干。
所有灭菌后的器皿、培养基只能在超净台打开使用。
使用巴斯德灭菌法灭菌的原水，也不能在超净台之外的地方打开使用。
长期没有使用了但曾经灭菌过的器材或培养基，如果需要使用，必须重新灭菌一次。
② 、培养基灭菌注意事项：
配制培养基的时候一些经过高压灭菌成分会发生改变的微量元素，应在灭菌后在超净台上用灭菌的注射器添加。如维生素，但是维生素的灭菌也必须很严格，往往藻种污染到细菌都是因为维生素引起的，可以使用0.22µm或0.45µm的滤膜来过滤维生素溶液。
土水（土壤侵出液）在蒸馏过后只能使用过滤的方法灭菌，不能经过高温高压灭菌。
洗净若干带橡皮塞的盐水瓶（800ml或500ml），将培养基注入，塞上橡皮塞。然后剪一小块纱布，包在橡皮塞外面，用棉线将塞子和瓶子缠紧，这样保证在灭菌的过程中，培养基不会把橡皮塞冲开。最后在橡皮塞头上插一个小针头，这个做法可以在灭菌的时候放气，也是为了保证培养基不会在灭菌的时候把橡皮塞冲开。然后开始灭菌。
灭菌结束后，立即降针头拔出。将培养基放置在洁净的地方，免受污染。

四、 藻种培养条件
1、 光照
培养一个藻种最初，先将少量的藻种转接到新鲜的培养基中，放在冷白荧光灯管（200－400footcandle）保持7～10天，观察最初的生长状况。生长较好以后，移到低光照区域（50－100footcandle），保持低速率的生长。
实验需要的藻种的培养中，我们推荐使用冷白荧光管来作为光照来源。因为如果使用白炽灯泡和直射的日光作为光源的话，光照会产热，改变培养的温度。在阳光照射下培养温度通常可以上升10C，如果一定需要日光作为光源，应将培养物放置在窗前，窗上用纸挡住。
培养的时候，光照与培养物的细胞密度也有关，一般密度比较小的时候，不适合使用较强烈的光照。我库提供的藻种，在细胞密度在105数量级左右时，我们推荐在2000lux的光照下培养。接种后，细胞密度很低的情况下，需要放置在弱光照下培养，随着细胞密度增大，逐渐加强光照。
培养藻类，每天要定期给一段时间的置于黑暗中培养。大多数藻种的光暗比都是12h：12h，也有16h：8h。
2、 温度
大多数淡水藻都可以在20～25C左右生长，高于30C有些蓝藻不能坚持到24小时就会死亡。一般所有的绿藻生长的温度相对比较广一些。在10C左右会几乎停止生长，但是不会死亡。非水华类的蓝藻更加可以耐低温的环境，低于10C还可以生存。但是水华类的蓝藻对温度要求更加精确一些，过高或者过低的温度都会死亡，即使留下待萌发的孢子，但是在实验室不具有底泥萌发的条件，藻种是不会再萌发出来的。
我库的大部分藻种，没有特别说明，其培养温度都是20～25C。
3、 特殊藻种培养要求
衣藻如果在营养丰富的培养基中生长，都会有变成类似四集藻型的趋势。所以建议培养的时候稀释一下SE培养基，或者用土水培养基来保持它的形态结构。
团藻属的藻类需要勤接种，使用营养太丰富的培养基，它可能会由群体散开成为单个游动的细胞。
培养含有叶绿素的鞭毛藻，可以用土水培养基加上一粒豌豆；无色的鞭毛藻，可以用土水培养基加上一两粒谷粒或者小麦。
硅藻可以使用很多种培养基来培养，但是培养基中必须含有硅，建议硅藻的培养基中Na2SiO3 . 9H2O达到10－30mg/l。
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3楼2009-12-03 15:57:21
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xingrl

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
liusong119323(金币+5,VIP+0):谢谢，请指教。 12-4 00:35
微藻的大量培养从不同的角度考虑可以分为多种类型：室内培养和室外培养；纯培养和单种培养；充气培养和不充气培养；静止培养和循环流动水培养；开放式培养和封闭式培养；一次性培养、半连续培养和连续培养。不知道LZ想用哪种培养方式进行大量培养，所用的器具和方法都有所不同，有时多种方式结合使用效果更好。但是，不同藻种或藻株其大量培养的适宜条件也存在差别。
估计你可能是实验室进行纯种封闭式一次性培养。
由于不知道LZ培养藻的种类、目的，也不好有过多的说明，如果感觉需要，我们可以继续交流
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4楼2009-12-03 19:41:17
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liusong119323

木虫 (小有名气)
主要要是短期大量培养铜绿微囊藻的方法。主要想知道的参数：菌液起始生长浓度，温度（由于条件有限目前的温度不会超过15度），光照强度，光照时间，及装置如何设计等问题。
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5楼2009-12-04 00:35:00
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xingrl

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
liusong119323(金币+5,VIP+0):好的，感谢了。 12-5 00:44
引用回帖:
Originally posted by liusong119323 at 2009-12-4 00:35:
主要要是短期大量培养铜绿微囊藻的方法。主要想知道的参数：菌液起始生长浓度，温度（由于条件有限目前的温度不会超过15度），光照强度，光照时间，及装置如何设计等问题。

铜绿微囊藻是一种淡水微藻，如果你想做培养的话，实际你提到的参数都应该是实验的内容，把每一个参数设成不同水平分别做单因素实验，根据单因素实验结果设计正交实验，最终得到一个优化的培养方法。
但我感觉你只是想要大量培养，说白了就是想要藻的数量多一些，主要用藻做其它方面的实验，这样的话没必要按照上面的说法来做，因为那需要比较长的时间，建议你不如直接找些该藻培养方法的文献参考，只要把藻的密度提高供试验用就可以了。相关的文献有很多。
希望说的这些对你有帮助。
最后友情提示：该藻分泌毒素，培养或试验后应妥善处理，尤其是死藻，否则对环境、对个人都有害。
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6楼2009-12-04 20:15:29
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