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[交流]
关于酶的等电点的测试方法
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各位大牛，有谁知道怎样测酶的等电点，能给出详细的步骤吗？非常感谢！ [ Last edited by amisking on 2009-12-1 at 19:42 ] |
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zhaocy8903
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2楼2009-12-01 18:35:17
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echobo(金币+2,VIP+0):谢谢 12-2 10:05
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（一）原理 等电聚焦技术是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。 本法的分辩率极高，所以在进行等电聚焦电泳时，要求样品不能过于复杂，一般应经其他方法（如层析法）提纯后再进行等点聚焦，才能得到比较满意的结果。如利用人的纯IgG再经过等电聚焦电泳，可以满意地分离IgG的四个亚类。如IgG2浓缩于pH7.0的部位，IgG3浓缩于pH8.0~9.0的范围内，IgG4则浓缩于pH6.0以下的部位，而IgG则分布于全部pH范围，且只有IgG1能存在于pH9.0以上的部位。 等电聚焦电泳与其他分离方法结合起来，将是一项很有前途的分析鉴定和制备样品的好技术。 （二）器材与试剂配制 1．聚焦柱 有成品出售，分110ml和440ml两种。 2．电源 0V~1 200V可调20W的直流稳压电源。 3．载体两极电解质 市售25ml瓶装，浓度为40％或20％（W/V），pH范围为2.5~11，也有其它pH范围的，可根据实验条件选择购买。 4．蔗糖（分析纯） 1． 电极液的配制见表： 表 正电极缓冲液的配制 正极在中心管内 正极在柱顶 磷酸 或硫酸 0.05（0.2）ml或1（4）ml 1Mol/L 酸溶液 0.025（0.1）ml或0.5（2）ml 1Mol/L 酸溶液 H2O 15（56）ml 5（25）ml 蔗糖 11（44）g 表2-3 负极缓冲液的配制 负极在中心管 负极在柱顶 氢氧 化钠 0.1（0.4）g或1（4）ml 0.05（0.2）g或0.5（2）ml 2Mol/L 溶液 2Mol/L 溶液 蒸馏水 14（56）ml 5（25）ml 蔗糖 11（44）g 此配制用量为最大用量，一般用1/5的量即可。括号内为440ml聚焦柱型号所用量配方。 6．重、轻液的配制与混合 ⑴重、轻液的配制：配制方法见表： 表 重、轻液的配制方法 110ml柱 440ml柱 载体40％（ml） 水及蛋白质溶液（ml） 蔗糖（g） 重液 1.9 37 26 轻液 0.6 51.5 重液 7.6 148 104 轻液 2.4 206 此表为梯度混合器所用量，如用手工混合法则应相应适当增加20％。 ⑵重、轻液的混合：有条件的可采用梯度混合器装柱。手工混合法操作如下：取24支试管（440ml聚焦柱则应取46支试管）按2-5表各加入重、轻液，充分混匀。 试管号 重液（ml） 轻液（ml） 试管号 重液（ml） 轻液（ml） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 （二）操作方法 1．决定电极的极性 如pH梯度范围在6以下时，则聚焦柱底的电极为正极。如pH梯度的范围在6以上时，则柱底为负极。原因是蔗糖浓度越大，电导越小，所以在等电点pH6～7的载体处，应该避免蔗糖浓度最大的部位。 2．装柱 按电极的极性与电极液的要求装柱。将聚焦柱垂直放置，先注入底部电极液，打开中心管下端的活塞，从中心管上端，用带长胶管的注射器注入电极液，使液面在中心管下部开口处之上达1cm处即可。 3．注入载体溶液 加完后应使电极液仍浸没中心管的下部开口，不使电极与载体溶液直接接触。 4．加重、轻混合液 从1号试管加起，用注射器沿管壁缓缓加入，流速约3ml/min，全部重、轻混合液加完后，再在上部加电极液，使上部电极浸没。 5．连接冷凝水管。 6．电泳 电压300V。开始电泳时，由于载体分子都不处于等电状态，所以它们都带电，在电场影响下向各自的等电点移动，因此开始时电流较大，以后逐渐减小。所以在开始时电压可稍低一些。电泳结束时电流约为0.30mA，电泳时间2～3天。 7．样品的收集 断电后，关闭中心管下端活塞以免电极液流出，放入样品，流速2ml/min为宜。以部分收集器收集，每管2ml。 8．测每管的pH值和蛋白含量，将相近pH的同一蛋白质的管合并。 9．将分离的每一样品成分过SepHadexG25（或G50），将蛋白质与载体分离开来。 |
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