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求教长片段PCR
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目的基因3.2Kbp 用了clontech的酶 怎么都没拉出来，只有1400bp左右的条带，有没有牛人能推荐个牛酶或者牛方法，让我能成功PCR啊？ [ Last edited by amisking on 2009-11-30 at 17:39 ] |
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4楼2009-11-30 15:15:58
gyesang
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+5,VIP+0):好细致 11-30 16:17
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LongAmp Taq DNA 聚合酶 LongAmp Taq DNA Polymerase 收藏 货号# 规格 价格 库存 #M0323S 500 units 789.00 元 有 #M0323L 2,500 units 3,609.00 元 有 #M0323 V 250 units 399.00 元 有 概述 LongAmp Taq DNA聚合酶是一种新型混合酶，混合有NEB高品质Taq 和广受欢迎的高保真聚合酶Deep VentR DNA聚合酶 。因而既具有Taq酶的强扩增能力(1)，也有Deep VentR DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性，增强其高保真性。LongAmp Taq DNA聚合酶保真度是Taq DNA聚合酶的6倍。长片段扩增能力强，λ DNA 可扩增至40 kb 和基因组 DNA可扩增至 30 kb。 来源 重组E. coli 菌株，含有从Thermus aquaticus YT-1克隆的Taq DNA 聚合酶和从 Pyrococcus species GB-D克隆的Deep VentR DNA 聚合酶。 应用 长片段PCR扩增。 贮存条件 100 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 7.4 @ 25°C), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.5% Tween-20, 0.5% NP-40 和 50% 甘油。 反应条件 50 μl反应体系中，1X LongAmp Taq 反应缓冲液，DNA 模板，引物，300 μM dNTPs 和5单位LongAmp Taq DNA 聚合酶。65°C温育。 1X LongAmp Taq 反应缓冲液 60 mM Tris-SO4(pH 9.0 @ 25°C), 20 mM (NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 3 % 甘油, 0.06 % NP-40, 0.05 % Tween-20。 单位定义 1单位，65℃条件下，反应30 分钟能使10 nmols的dNTPs掺入酸不溶性物所需的酶量。 单位检测条件 1X ThermoPol 反应缓冲液, 200 μM dNTPs包含[3H]-dTTP 和 200 μl/ml 活性小牛胸腺 DNA。 热失活 无。 贮存 -20°C贮存两年。长期贮存请贮存于 -80°C 。 质量控制检测 经扩增检测，以λ DNA为模板，LongAmp Taq DNA聚合酶可扩增出40 kb产物，以人类基因组DNA为模板扩增出30 kb基因片段。 LongAmp Taq DNA聚合酶反应步骤 1.按照下列顺序添加反应成分至PCR反应薄壁管中，所有PCR操作过程应在冰上进行： 注意：反应前混匀反应液。扩增20 kb以上的片段时，避免加样过程中目的DNA片段的污染。反应前快速离心收集反应液至离心管底部。如果PCR反应机器没有加热盖，可在样品顶部添加石蜡油防止挥发。 2.PCR反应管放置于PCR仪中，PCR仪需提前加热到94-95°C，然后进行下面的循环反应： 起始变性: 94-95°C 30 seconds 25-45 个循环: 94-95°C 10 seconds 50-65°C 10-60 seconds 65°C 50 seconds per kb 终延伸: 65°C 10 minutes 保持: 4-10°C 总体反应原则 1.建立反应体系： 顺序添加反应液中各成分，冰上操作，迅速将PCR管置于预热温度为94-95癈的PCR仪上进行变性。 2 模板： 模板DNA量对于长片段PCR产物的扩增起重要作用。50 靗反应体系中添加的DNA模板量见下表： 扩增产物片段长度大于20 kb成功与否很大程度上取决于添加的模板DNA的量和引物序列。 3. 引物： 一般而言，引物长度为20－40个碱基，理想GC含量为40-60%（2）。引物软件Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) 可以设计和分析引物。扩增产物片段长度大于20kb，GC含量需大于50%，相对应的Tm值大于60癈，同时引物长度至少24个碱基。通常每条引物的终浓度为0.05-1 μM，最佳浓度为0.2-0.5 μM。 4. Mg2+ 浓度和添加物 1X 反应缓冲液中Mg2+ 浓度为 2 mM。这个浓度适用于大多数扩增反应。然而，可以用MgSO4调节Mg2+ 浓度，以0.2 mM递增。 对于富含GC的复杂模板，可以添加 DMSO (3) 和甲酰胺(4)帮助扩增。 5. 变性： 对于大多数模板来说，初始变性通常在94-95°C，变性30秒。富含GC的复杂模板，在PCR反应前使模板完全变性，建议初始变性在94- 95°C，变性2-4分钟。如果是克隆PCR，建议初始变性在94-95°C，变性5分钟。随后的变性反应时间10-30秒。 6. 退火： 对于大多数反应来说，退火时间为10-60秒。退火温度可以按照计算出的Tm值以5°C为梯度降低进行优化。 7. 延伸： 延伸温度为65°C。扩增片段长度在20 kb以下，延伸温度在60－68°C间变化。建议终延伸温度为65°C，延伸10分钟。 8. 两步法 PCR: 如果引物的退火温度在60°C以上，可以按照下面的两步法 PCR反应步骤进行操作： 起始变性: 94-95°C 30 seconds 25-45 个循环: 60-65°C 10 seconds 60-65°C 50 seconds per kb 终延伸: 60-65°C 10 minutes 保持: 4-10°C 9. 循环数: 一般扩增反应循环反应25-35个之间进行优化,对于低拷贝的目的片段,可增加至45个循环反应. 参考文献 1. Barnes, W.M. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 2216-2220. 2. Foord, O.S. and Rose, E.A. (1994) PCR Methods Appl., 149-161. 3. Sun, Y. et al. (1993) Biotechniques, 15, 372-374. 4. Sarkar, G. et al. (1990) Nucleic Acids Res 18, 7465. 单独销售的相关产品 LongAmp Taq (Mg-free) Reaction Buffer Pack Deoxynucleotide Solution Set B0322S 6.0ml N0446S 25 μmol of each Deoxynucleotide Solution Mix N0447S 8 μmol of each N0447L 40 μmol of each |
2楼2009-11-30 14:41:58
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
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专家经验: +24 - BioEPI: 1
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3楼2009-11-30 14:42:43