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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by jiangkuo0520 at 2009-11-26 15:34:
还是不大明白啊

我又发了个 PQE30的图,谢谢大家
11楼2009-11-26 15:44:56
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qingfengwu

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
jiangkuo0520(金币+3,VIP+0):谢谢,SAL I 酶 怎么样啊? 我看在片段1和PQE30上都有这个酶切位点 11-26 16:04
jiangkuo0520(金币+1,VIP+0): 1-1 14:53
这个简单,为了最有效的进行克隆,我建议选择pQE上酶切效率最高的两个酶。你可以这样设计引物:

使用pQE上的BamHI和HindIII两个酶切位点。

forward:   随机碱基2-3个+BamHI序列+基因片段5‘端 20bp
reverse:   随机碱基2-3个+HindIII序列+基因片段3’端 complementary reversed 20bp

注意载体上是否直接链接tag,如果有的话,要把3‘端的终止密码子去掉。
12楼2009-11-26 15:49:02
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qingfengwu

金虫 (小有名气)

SalI这个酶还可以的。不过你要去查一下takara公司的双酶切,这个SalI酶,好像效率上还是差一点,不过做出来肯定是没有问题的。总体上来讲,如果不是同源双酶切,直接转接过去的话,你都是要PCR克隆扩增的,没有必要一定要用SalI 。
13楼2009-11-26 16:12:06
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

谢谢楼上的朋友,我这个搞骨科的突然搞起基因工程,真的是头大!
14楼2009-11-26 16:45:26
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by qingfengwu at 2009-11-26 15:49:
这个简单,为了最有效的进行克隆,我建议选择pQE上酶切效率最高的两个酶。你可以这样设计引物:

使用pQE上的BamHI和HindIII两个酶切位点。

forward:   随机碱基2-3个+BamHI序列+基因片段5‘端 20bp
rev ...

随机碱基有什么要求么?基因片段5‘端 20bp怎么找呢?
15楼2009-11-26 19:11:57
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


jiangkuo0520(金币+1,VIP+0): 11-26 20:18
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-11-26 12:51:
看能找到同尾酶不,如果有合适的同尾酶酶切位点,可以省掉PCR过程了。

Takara商品目录中,有isoschizomer一览表。
Thank-you,so-blue.
16楼2009-11-26 19:49:53
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-11-26 19:49:

Takara商品目录中,有isoschizomer一览表。

谢谢!
17楼2009-11-26 20:15:48
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

forward:   随机碱基2-3个+BamHI序列+基因片段5‘端 20bp
reverse:   随机碱基2-3个+HindIII序列+基因片段3’端 complementary reversed 20bp
这个3’5‘端20个碱基怎么确定呢?谢谢
18楼2009-11-26 20:31:32
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gastrodia

金虫 (正式写手)

★ ★
jiangkuo0520(金币+2,VIP+0): 11-27 08:49
5‘端引物20bp,从ATG(起始密码子)的A向后数,
3’端20bp从TAG或者TAA(终止子)向先数,数够20bp用其反向互补链即可,
建议楼主直接找你师兄要他扩此序列的引物,只要将他引物序列上的酶切点序列换成你的酶切点序列即可
19楼2009-11-26 22:28:11
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-11-26 22:28:
5‘端引物20bp,从ATG(起始密码子)的A向后数,
3’端20bp从TAG或者TAA(终止子)向先数,数够20bp用其反向互补链即可,
建议楼主直接找你师兄要他扩此序列的引物,只要将他引物序列上的酶切点序列换成你的酶切 ...

谢谢!
20楼2009-11-27 08:49:54
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