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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR引物设计求助（有图）
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jiangkuo0520 at 2009-11-26 15:34:
还是不大明白啊

我又发了个 PQE30的图，谢谢大家
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11楼2009-11-26 15:44:56
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qingfengwu

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
jiangkuo0520(金币+3,VIP+0):谢谢，SAL I 酶 怎么样啊？ 我看在片段1和PQE30上都有这个酶切位点 11-26 16:04
jiangkuo0520(金币+1,VIP+0): 1-1 14:53
这个简单，为了最有效的进行克隆，我建议选择pQE上酶切效率最高的两个酶。你可以这样设计引物：

使用pQE上的BamHI和HindIII两个酶切位点。

forward:   随机碱基2－3个＋BamHI序列＋基因片段5‘端 20bp
reverse:   随机碱基2－3个＋HindIII序列＋基因片段3’端 complementary reversed 20bp

注意载体上是否直接链接tag，如果有的话，要把3‘端的终止密码子去掉。
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12楼2009-11-26 15:49:02
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qingfengwu

金虫 (小有名气)
SalI这个酶还可以的。不过你要去查一下takara公司的双酶切，这个SalI酶，好像效率上还是差一点，不过做出来肯定是没有问题的。总体上来讲，如果不是同源双酶切，直接转接过去的话，你都是要PCR克隆扩增的，没有必要一定要用SalI 。
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13楼2009-11-26 16:12:06
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
谢谢楼上的朋友，我这个搞骨科的突然搞起基因工程，真的是头大！
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14楼2009-11-26 16:45:26
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by qingfengwu at 2009-11-26 15:49:
这个简单，为了最有效的进行克隆，我建议选择pQE上酶切效率最高的两个酶。你可以这样设计引物：

使用pQE上的BamHI和HindIII两个酶切位点。

forward:   随机碱基2－3个＋BamHI序列＋基因片段5‘端 20bp
rev ...

随机碱基有什么要求么？基因片段5‘端 20bp怎么找呢？
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15楼2009-11-26 19:11:57
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
jiangkuo0520(金币+1,VIP+0): 11-26 20:18
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-11-26 12:51:
看能找到同尾酶不，如果有合适的同尾酶酶切位点，可以省掉PCR过程了。

Takara商品目录中，有isoschizomer一览表。
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Thank-you，so-blue.
16楼2009-11-26 19:49:53
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-11-26 19:49:

Takara商品目录中，有isoschizomer一览表。

谢谢！
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17楼2009-11-26 20:15:48
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
forward:   随机碱基2－3个＋BamHI序列＋基因片段5‘端 20bp
reverse:   随机碱基2－3个＋HindIII序列＋基因片段3’端 complementary reversed 20bp
这个3’5‘端20个碱基怎么确定呢？谢谢
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18楼2009-11-26 20:31:32
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★
jiangkuo0520(金币+2,VIP+0): 11-27 08:49
5‘端引物20bp，从ATG（起始密码子）的A向后数，
3’端20bp从TAG或者TAA（终止子）向先数，数够20bp用其反向互补链即可，
建议楼主直接找你师兄要他扩此序列的引物，只要将他引物序列上的酶切点序列换成你的酶切点序列即可
赞一下(1人) 回复此楼
19楼2009-11-26 22:28:11
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-11-26 22:28:
5‘端引物20bp，从ATG（起始密码子）的A向后数，
3’端20bp从TAG或者TAA（终止子）向先数，数够20bp用其反向互补链即可，
建议楼主直接找你师兄要他扩此序列的引物，只要将他引物序列上的酶切点序列换成你的酶切 ...

谢谢！
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20楼2009-11-27 08:49:54
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