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【求助】罗红霉素的高效液相试验问题
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大家好，我是注册新人，近期在做罗红霉素制剂的注册，液相试验遇到无法解决的问题，请大家指教。 问题情况如下 罗红霉素的2005年版药典中规定含量测定使用高效液相，以0.067mol/L的磷酸二氢铵溶液（三乙胺调PH 值至6.5）:乙腈（65:35）为流动相，十烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为210nm，罗红霉素的保 留时间不小于9分钟，理论塔板数不得低于2500。 液相仪器为岛津，LC-20AD泵，SPD-S0AV检测器，CBM-20A控制器 试剂为：Burdick&Jackson的乙腈，Tedia的三乙胺，成都科龙化工的磷酸二氢铵（250mm柱阶段使用的是 温州某厂的产品，有好几年历史了……后来还试过国药的） 刚开始时使用250mm的柱子，保留时间约为22min，拖尾因子大于2。于是决定微调水溶液PH值以求改善峰 形和保留时间。但几次试验后发现原条件的保留时间和拖尾发生突变，保留时间约为12min，拖尾为1.3 左右，配制流动相中发现调PH消耗的三乙胺量明显变大。使用的试剂前后均没有任何变化（均出自同一 瓶，乙腈出自同一批）。虽然心存疑虑但还是使用了该条件进行试验，一段时间后发现保留时间再次突 变至20min多且无法改变。于是只能废弃之前数据，考虑到试剂被污染的可能性，重新购买了乙腈和磷酸 二氢铵（三乙胺未换），使用国药的磷酸二氢铵后保留时间同样为22min，后购买成都科龙化工的磷酸二 氢铵。 此时怀疑原温州产磷酸二氢铵被其他盐类污染而导致酸碱性变化（这瓶试剂已经严重结块，不知是否有 影响），但进行常见酸根离子的化学鉴定都没有检出对应酸根（硝酸根有检出，实验室的说法是试验用 水常含硝酸根，用空白试验用水所作的对照与样品颜色对比也不显著），由于单位缺少更多相应仪器和 试剂，进一步的分析也无法进行。保留时间的突变是第一个无法解决的问题。 考虑到试验时间特别是有关物质试验的时间消耗，改使用150mm柱与新购买试剂进行试验，保留时间约为 10min~11.5min，拖尾因子变化较大，从1.4~2.2都有可能出现，理论塔板数可为3300~4500，偶尔保留时 间也会向前或向后突变，但少见，虽然试验证明温度对保留时间影响明显，但使用柱温箱后仍偶尔发生 保留时间突变。做到有关物质时，样品浓度的变高导致理论塔板数下降，勉强在2500多一些，但近期常 发生理论塔板数只有2100~2500的情况，而保留时间也常提前（最多可能提前到小于9min）。流动相是每 天配制且使用相同仪器与器皿，液体的量取可能每次有所误差但不可能有这么明显的比例差异。发生保 留时间提前的时候测试过昨日时间正常的流动相，时间仍正常。每天所用的磷酸二氢铵都使用分析天平 进行称量，精确到小数点后两位，但个人仍感觉调PH所消耗的三乙胺量有所差异。近来由于理论塔板数 和保留时间的问题，做有关物质做得十分不顺，常白耗一天的时间。 请大家指教这试验中可能存在的问题与解决方法，谢谢大家。 |
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4楼2009-11-25 16:04:52
akosrios
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流动相是每 天配制且使用相同仪器与器皿，液体的量取可能每次有所误差但不可能有这么明显的比例差异。发生保 留时间提前的时候测试过昨日时间正常的流动相，时间仍正常。每天所用的磷酸二氢铵都使用分析天平 进行称量，精确到小数点后两位，但个人仍感觉调PH所消耗的三乙胺量有所差异。近来由于理论塔板数 和保留时间的问题，做有关物质做得十分不顺，常白耗一天的时间。 根据你说的情况，关于保留时间的问题，那只能从你的流动相配置上找原因，仔细注意每个过程，也只能这样了 至于理论塔板数，这就不是你能解决的问题了，是柱子的问题。罗红本来就比较难做，拖尾很正常，柱子的寿命也会很短，一般能到两个月就不错了，而且很多品牌的柱子都达不到要求。 |
5楼2009-11-26 11:17:23
