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kevin.wee金虫 (小有名气)
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[交流]
请western blot 高手们指点！
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最近在做WB方面的实验，很不顺利，希望能得到高手们指点。首先请帮忙分析下我做的图片 各泳道对应样本：1-control liver；2-sample liver；3 C-spleen；4 S-spleen；5 C-muscle；6 S-muscle；7同1，8同2，9同3，10同4，11为预染maker 下面的是内参的结果（beta-actin），上面部分为要检测的ubiquitin。上样量每孔8ul（蛋白浓度6.98ug/ul），电泳时间200V 40分钟，用的是invitrogen的胶，电泳缓冲液，抗体不记得是哪的了，实验室其他同事都在用，干转的，ECL显影1-2分钟，这张图片是曝光40分钟的图片，在BIO-RAD机器上直接爆的。 问题1：Ubiquitin为什么一点都没有检测到？(用的别人回收的一抗液，同事们经常这么做，都 挺好的，我刚做，为什么我的就不行呢？） 2：muscle为什么会产生如此多的条带？ 3：同样的上样量，为什么检测各泳道actin的检测条带差异却如此大?（前期QC标准曲线 R2=0.998 4：预染maker上也能检测到actin？ [ Last edited by amisking on 2009-11-23 at 13:08 ] |
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kevin.wee
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3楼2009-11-23 16:12:13
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（1）把actin和ubiquitin剪开来分别上抗体，然后一起压片，不要放在一张膜上面上两个抗体，如果这两个抗体的源性一样，那更完蛋了。actin这东西爆强，ubiquitin不如它，就很容易被actin抢走所有的二抗。 （2）muscle里面为什么actin都讲解了，可能是你样品制备的不够仔细。放在冰上面操作，多做几次你一定能成功的。 （3）测蛋白浓度定量是不太准的，但是不准也要测，你总体样品上的量也太多了吧。我们都是总量上20ug左右就足够了。你上了50－60ug。少一点，actin的variation就会少很多。 （4) marker的一些条带被actin抗体染上很正常的，不用担心，actin抗体一般都是非常好的，marker里面的成分很多又不太清楚，所以还是非常有可能把marker条带给染上的。好的抗体多数都会把marker给标出一点。但是各个公司的marker不一样，所以也不一定，我们实验室用的marker就是会被染上的。 |
2楼2009-11-23 12:10:00
