| 查看: 25 | 回复: 0 | |||
科研战神来了新虫 (小有名气)
|
[交流]
新手也能复刻，流式细胞凋亡检测完整思路
|
|
🧪 实验原理凋亡早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）外翻至膜外侧，可被Annexin V特异性结合。碘化丙啶（PI）无法穿透完整细胞膜，仅能进入膜完整性受损的晚期凋亡或坏死细胞，与 DNA 结合发出红色荧光。通过荧光信号差异区分不同细胞亚群：活细胞（AV⁻PI⁻）、早期凋亡细胞（AV⁺PI⁻）、晚期凋亡 / 坏死细胞（AV⁺PI⁺）。 ✅ 前期准备器材：流式管、1.5 mL EP 管、细胞筛网、低速离心机、流式细胞仪试剂：胰蛋白酶、完全培养基、无菌 PBS、1× Annexin V Binding Buffer、Annexin V 染液、PI 染液1.细胞收集提前收集孔板内的培养上清，转移至对应标记离心管中备用；向孔板内加入500 μL 胰酶，置于 37℃培养箱消化细胞 1 min。消化结束后加入2 mL DMEM 完全培养基，中和胰酶终止消化，将孔内全部液体转移到装有上清的离心管内。2.洗涤细胞1000 rpm离心 5 min，弃去上清；加入 1 mL 无菌 PBS 重悬细胞，转移至 1.5 mL EP 管，再次1000 rpm离心 5 min，弃上清。3.重悬准备染色沉淀内加入200 μL 1× AV binding buffer轻柔重悬细胞。对照组单独设置，用于荧光补偿调节：空白管、Annexin V 单染管、PI 单染管、各实验组。4.荧光染色上机前 15 min 进行染色操作，单管体系加入2 μL Annexin V、4 μL PI 染液，轻柔混匀。样本数量较多时，可提前配制染色混合母液，预留损耗体积。举例：一共 10 个样本，AV 总量 = 10×2=20 μL，PI 总量 = 10×4=40 μL，额外多配 10 μL 余量，总体系 110 μL，补加 50 μL 1× binding buffer，混匀瞬时离心后，每管分装10 μL混合染液。5.过滤与上机染色完成后将样本放置于冰上，使用细胞筛网过滤细胞悬液至流式管，去除细胞团块，随即上机采集检测。6.圈门分析策略先剔除左下角细胞碎片信号，用不规则门圈选总细胞群体；再通过FSC-A/FSC-H参数圈出单细胞，排除粘连细胞。十字门划分四个象限： 右上角：晚期凋亡细胞（AV⁺PI⁺双阳性）右下角：早期凋亡细胞（AV⁺PI⁻单阳性）左下角：活细胞（AV⁻PI⁻双阴性）左上角：坏死细胞（AV⁻PI⁺单阳性）  |
回复此楼» 猜你喜欢
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有5人回复
-
售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有9人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有9人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有10人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急
已经有6人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急
已经有9人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急
已经有7人回复
-
27博士申请（市政/环境）
已经有3人回复
-
27博士
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
