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类器官实验常见问题解答！
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1.类器官是由单一细胞类型构成，还是多细胞结构？ 类器官是通过体外三维（3D）培养，由成体干细胞或多能干细胞衍生而来的三维组织类似物。它们并非由单一细胞类型构成，而是起源于具有祖细胞特性的干细胞，经增殖、分化后自组装形成多细胞结构，能够模拟体内对应器官的形态、结构和功能。 2.类器官培养的样本来源有哪些？ 干细胞来源类器官：包括成体干细胞（ASC）、多能干细胞（PSC）和诱导多能干细胞（iPSC）； 组织来源类器官：最常见的是由肿瘤组织建立的肿瘤类器官。 3.无新鲜组织时，冻存组织能否用于三维培养？ 可以，但冻存组织的大小至关重要。此外，原代冻存组织和细胞的活力会显著下降，这会大幅降低后续培养的成功率。 4.类器官如何进行冻存与复苏？ 类器官最佳冻存时机为传代 2 至 5 代（P2-P5），此时其活力和分化潜能处于最优状态。类器官复苏可遵循标准的细胞复苏操作流程。 5.是否需要控制培养类器官的大小？越大越好吗？ 需要，大小控制至关重要。由于类器官缺乏血管和液体循环系统，其直径理想情况下应保持在 500μm 以下。当类器官体积过大时，氧气和营养物质的扩散受限，核心区域细胞无法获得充足供应，导致中心部位细胞死亡增加。 6.除基质胶（Matrigel）外，还有哪些材料可用于类器官培养？ 可替代的基质材料包括： 脱细胞细胞外基质（dECM）及其衍生蛋白； 合成水凝胶； 工程化重组蛋白凝胶。 7.如何实现类器官的定向分化？ 干细胞来源类器官的早期发育受多条信号通路调控。体外培养时，可通过添加特定生长因子和细胞因子模拟这些信号通路，从而引导细胞定向分化。 例如，Y27632 和激活素 A（Activin A）可诱导多能干细胞（PSC/iPSC）分化为定形内胚层（DE），随后添加 Wnt3a、成纤维细胞生长因子 4（FGF-4）和头蛋白（Noggin），可进一步引导细胞向特定谱系分化。 8.采集临床样本时如何避免污染？ ①尽可能在无菌条件下进行样本采集； ②用含双抗（如青霉素 / 链霉素）的 PBS 预处理组织：对于暴露于外界环境的组织（如胃癌、肠癌、膀胱癌组织），需在含 3%-5% 双抗的 PBS 中浸泡 5-10 分钟；其他组织则使用含 1%-2% 双抗的 PBS 浸泡约 5 分钟； ③细胞分离过程中使用的所有试剂均需添加 1% 双抗及适量原代细胞专用抗生素。 9.肿瘤组织的采集、保存和运输有哪些注意事项？ 应尽可能采集富含肿瘤细胞的组织，并尽量缩短样本暴露于空气的时间以降低污染风险。采集后立即将组织放入装有专用保存液的无菌试管中，在低温（约 4℃）条件下快速转运至实验室，理想情况下应在采样后 2-4 小时内送达。 10.肿瘤病灶来源类器官与癌旁正常组织来源类器官是否存在差异？肿瘤组织采样有哪些要求？ 存在差异。肿瘤本身具有异质性，不同区域来源的类器官往往表现出形态和功能上的差异。与癌旁正常组织来源的类器官相比，原发肿瘤部位的类器官通常呈现出更不规则、更具侵袭性的结构。为了降低建模或药物筛选过程中的变异性，应从肿瘤的多个活性区域采集样本。 11.患者来源类器官（PDO）药物敏感性检测可用于测试哪些类型的药物？ 适用于 PDO 检测的抗肿瘤药物主要包括以下几类： ①细胞毒性化疗药物（如紫杉醇、顺铂 / 卡铂、5 - 氟尿嘧啶）； ②靶向治疗药物（如针对 EGFR、HER2、VEGFR 的抑制剂）； ③免疫治疗药物，尤其是免疫检查点抑制剂（如 PD-1/PD-L1 抗体）。 12.PDO 培养的成功率是多少？ 成功率因组织来源略有差异，但总体在 63%-70% 之间，部分研究报道可达 90%。培养成功率高度依赖于组织活力，优化临床处理流程并缩短离体时间可提高成功率。 13.冻存组织能否用于类器官培养？ 由于冻存会导致组织活力显著下降，一般不推荐使用冻存组织进行类器官培养。但若组织已保存在 - 80℃，则应在 6 周内完成类器官培养；对于液氮保存的组织，可适当延长保存时间，但建议在 6 个月内进行培养以获得最佳效果。 14.原代细胞分离过程中常混有成纤维细胞，应如何处理？ 利用成纤维细胞贴壁能力较弱的特点，通过多次预铺板去除大部分污染的成纤维细胞； 使用市售的成纤维细胞清除试剂盒，但需通过实验验证其对类器官形成的影响。 15.肿瘤类器官培养需要多少肿瘤组织？活检材料是否足够？ 对于手术切除标本，肿瘤组织体积应大于 2-3 粒豌豆大小；对于粗针穿刺活检标本，建议至少采集 2-3 条穿刺组织；对于内镜活检标本，至少需收集 6 块组织碎片。 16.若初始肿瘤组织量少，培养获得的类器官不足以进行后续检测，该如何处理？ 由于传代过程中可能出现表型漂移，不建议进行过度扩增。文献建议传代次数应限制在 2-3 代（最多不超过 5 代）。若传代 5 代后细胞数量仍不足，可考虑改用 384 孔板或微流控芯片等检测平台，以减少检测所需的样本体积。 17.肿瘤组织中是否含有正常细胞？如何去除？ 是的，肿瘤组织中可能含有少量正常细胞。解剖时应尽可能避开正常组织；原代细胞分离后，可在类器官培养前采用磁激活细胞分选（MACS）或荧光激活细胞分选（FACS）技术富集肿瘤细胞。少量正常细胞通常不会对类器官建模产生显著影响，可予以保留。 18.从肿瘤组织中提取的原代细胞有时呈红色，原因是什么？ 肿瘤组织血管丰富，因此常残留红细胞。少量红细胞不会干扰类器官培养；若红细胞污染严重，可在培养前使用红细胞裂解液进行处理。 19.类器官培养过程中出现黑色颗粒，应如何去除？ 黑色颗粒可能是细胞碎片或组织残渣，可采用以下两种方法去除： 将类器官消化为单细胞，用培养基反复洗涤以稀释污染物； 用无菌手术刀将类器官切成两半，再用 1mL 注射器吸取培养基轻轻冲洗类器官内部。 20.类器官的传代次数是否有限制？最多可传多少代？ 传代次数取决于来源细胞类型。大多数类器官在体外可传代至 10 代（培养时间 > 6 个月）。培养基配方也会影响传代次数 —— 条件培养基通常比成分完全确定的合成培养基更能支持类器官的长期扩增。 21.肿瘤细胞系（如 HepG2）能否培养成患者来源类器官（PDO）？ 不能。PDO 是来源于异质性组织的复杂自组装三维结构。由单一永生化细胞系形成的三维球状体不属于 PDO，应称为三维球状体或肿瘤球。 22.类器官传代的判断标准是什么？ 传代时机取决于类器官的生长状态。通常情况下，当类器官直径达到 100-200μm 时，每 5-10 天传代一次；部分生长缓慢的类器官可能需要数周才能达到传代大小。 23.如何计数活的类器官？ 向培养基中加入钙黄绿素 - AM（Calcein-AM）至终浓度为 0.2μmol/L，37℃孵育 60 分钟。用 PBS 轻轻洗涤以去除多余染料，然后加入新鲜培养基。在荧光显微镜下，使用 490nm 激发光和 515nm 发射光进行观察，活的类器官呈现清晰的绿色荧光。计数直径大于 20μm 的类器官数量。 24.如何计算类器官的存活率？ 类器官存活率计算公式如下： X = (N 活 / N 总) × 100% 其中： X = 类器官存活率（%） N 活 = 活类器官数量 N 总 = 类器官总数量 25.类器官的鉴定方法有哪些？ 基础鉴定包括光学显微镜观察和苏木精 - 伊红（H&E）染色以评估形态学特征；进一步验证可采用蛋白质印迹法（Western blot）、实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）、免疫荧光染色和流式细胞术检测谱系特异性生物标志物；基因组测序可评估类器官与来源组织的遗传一致性；功能学检测（如胃类器官的胃酸分泌功能、心脏类器官的自发搏动功能）可提供额外的验证依据。 26.正常细胞能否形成类器官？肿瘤类器官培养过程中如何去除正常类器官？ ①正常上皮细胞也能形成类器官。可通过以下方法富集肿瘤类器官： ②在显微镜下根据 H&E 染色形态手动挑取肿瘤类器官； ③优化培养基配方（如添加选择性抑制剂），促进肿瘤类器官生长并抑制正常类器官； ④将类器官消化为单细胞，通过 FACS 或 MACS 技术富集肿瘤细胞。 27.进行药物敏感性检测前，是否需要将 PDO 从基质胶中解离出来？ 不需要。三维结构对于重现体内药物反应至关重要，去除基质胶会破坏类器官的结构完整性，降低检测准确性。大多数可溶性药物能够穿透基质胶。但在进行免疫细胞共培养或细胞毒性检测时，可能需要去除基质胶。 28.PDO 模型能否完全替代动物模型（如 PDX 模型）？ PDO 可部分替代人源肿瘤异种移植（PDX）模型，但无法完全取代。动物模型能够更好地模拟体内系统性药物代谢、肿瘤微环境相互作用、免疫浸润和转移等复杂生物学过程，而这些过程目前尚无法在体外完全重现。 29.若 PDO 出现生长异常（如传代周期缩短、增殖速度加快），可能的原因是什么？ 外部因素： 被快速生长的细胞（如成纤维细胞）污染，可通过组织学染色进行鉴定； 培养基成分发生变化（如添加了促生长因子）。 内部因素： 发生基因突变，可通过测序并与早期传代的 PDO 进行比对确认。 30.如何评估 PDO 的药物敏感性？ 常用方法包括 CCK-8 法、基于 ATP 的细胞活力检测法和活 / 死细胞染色法。其中 ATP 检测法应用最为广泛，因为 ATP 水平能够反映细胞的代谢活性和活细胞数量。通过分析软件计算半数抑制浓度（IC50）值，以筛选出最有效的药物。 31.在药物敏感性检测中，PDO 与原代肿瘤细胞的药物浓度范围是否相同？ 不同。PDO 的有效药物浓度通常高于二维培养的原代细胞。建议在正式药物检测前进行预实验（剂量摸索实验），确定合适的药物浓度范围。 32.处于哪个阶段的类器官适合进行药物检测？ 药物检测最好使用传代 5 代以内的类器官，此时其遗传稳定性和生物学活性最高。 33.类器官建系成功的判定标准是什么？ ①早期形态学改变：形成囊性、出芽状、致密或松散的三维结构； ②免疫染色证实表达谱系特异性生物标志物，且表达模式与原始组织一致； ③通过测序进一步验证，确认类器官与来源组织具有遗传相似性。 34.类器官培养与传统二维细胞培养的主要区别是什么？ ①培养方式：类器官需要三维支架（如基质胶）维持结构；二维培养则在平面表面生长。 ②分化程度与复杂性：类器官可在体外进行分化和自组装，需要含有多种生长因子的复杂培养基；二维培养通常为单一细胞类型，使用成分相对简单的培养基。 ③细胞来源：类器官来源于多能上皮干细胞；二维培养可使用多种细胞类型，包括永生化细胞系。 35.如何确认一个三维结构是与目标组织匹配的真正类器官？ 采用多模态验证方法：包括 H&E 染色、免疫组织化学（IHC）和单细胞 RNA 测序。对于肿瘤类器官，需检测已知肿瘤生物标志物的表达情况。 36.为什么我培养的类器官形态与文献报道的存在差异？ 形态差异可能源于以下因素： 患者间异质性和肿瘤亚型差异； 生长因子的质量或批次差异； 培养条件不同。 建议通过 H&E 染色、IHC 和测序将类器官与来源组织进行比对，以验证其身份。不同实验室培养的类器官形态可能存在差异，不应严格局限于已发表的图片。 37.在类器官药物检测中，使用 DMSO 作为溶剂，是否需要控制其浓度？ 需要。DMSO 的终浓度一般应控制在 0.5%（v/v）以下，以避免产生细胞毒性。 38.如何从基质胶中回收类器官？ ①推荐方法：使用市售的类器官回收液，其可温和解离基质胶，且不会损伤细胞或细胞表面蛋白。 ②替代方法：将样本置于冰上使基质胶液化，然后轻轻吹打以释放类器官。 39.类器官回收过程中，很多类器官会黏附在管壁上，如何提高回收率？ 收集样本后，使用水平转子离心机进行离心；可适当提高离心力（如约 300×g，1000-1200rpm），使类器官有效沉淀，从而减少管壁黏附。 |
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