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科研战神来了新虫 (小有名气)
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3D 肿瘤球长不均、容易散？这套方案帮你稳定成球
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3D 肿瘤细胞成球实验是肿瘤干细胞研究常用体外模型，依靠超低粘附培养条件诱导细胞聚集形成细胞球，可用于干性相关检测、药物敏感性评估、标志物验证等方向。 一、实验目的反映肿瘤细胞的干性、增殖能力与侵袭潜能，常用于肿瘤干细胞研究。检测干细胞标志物表达，成球后细胞更容易富集表达Oct4、Sox2、Nanog等。开展抗肿瘤药物敏感性检测，3D 成球模型对化疗药物反应更贴近真实肿瘤反应。筛选具备肿瘤干细胞特性的亚群，通过悬浮培养选出具备自我更新能力的细胞。 二、实验原理在无黏附条件下，例如超低粘附培养板，肿瘤细胞无法贴壁生长，只能通过相互聚集形成细胞球（spheroid）。形成的球体可以体现细胞聚集、增殖、细胞间通信等能力，还可以构建类似实体瘤的分层结构，包含外层增殖细胞、中层静止细胞、核心坏死区域。 三、实验材料与试剂对数生长期的 MCF-7 细胞，可根据实验需求更换其他肿瘤细胞株。无血清诱导培养基，配方为DMEM/F12 基础培养基添加 B27、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF。超低粘附培养板，优先选用96 孔 U 底培养板或 6 孔板。胰酶、无菌 PBS。倒置显微镜，共聚焦显微镜可用于后续免疫荧光拍摄。⚠️ 提示：如果实验目的为富集肿瘤干细胞，必须选用无血清、添加生长因子的诱导培养基。 四、可选下游实验分析药物处理：在培养第 3 天加入待测药物，继续孵育48–72 h后观察球体形态、大小变化。免疫荧光染色：观察肿瘤球形态，检测CD44⁺/CD24⁻、ALDH1等干细胞标志物。qPCR、Western blot：检测SOX2、OCT4、NANOG等干性相关分子的表达水平。五、实验操作步骤Step 1：细胞准备收集处于对数生长期的 MCF-7 细胞，不要使用传代次数过高或者状态变差的细胞。胰酶充分消化细胞，PBS 洗涤 1 次，重悬至无血清诱导培养基内。细胞计数后，调整细胞悬液浓度至 1000 cells/mL 左右。Step 2：接种细胞96 孔 U 底超低粘附板，单球培养模式：每孔加入100 μL 细胞悬液，对应每孔约 100 个细胞，放置于37℃、5% CO₂培养箱培养。适合球体形成动态监测、直径测量、药物敏感性实验。6 孔超低粘附培养板，多球培养模式：每孔加入2–4 mL 细胞悬液，每孔细胞总量控制在2×10⁴～1×10⁵个，可结合实验目标调整。轻柔摇匀后放入培养箱。适合后续 RNA 提取、蛋白提取，需要收集大量球体的实验。Step 3：球体培养每隔2–3 天更换 1/2 体积培养基，从孔板边缘缓慢吸弃旧培养基，操作轻柔，避免吸走、打散细胞球。持续培养5–7 天，使用倒置显微镜定时观察成球情况，记录球体数量与尺寸。Step 4：结果评估成球率（Sphere formation efficiency, SFE）计算公式：成球孔数 / 总孔数 ×100%。球体直径（μm）用来反映细胞增殖能力。共聚焦显微镜拍摄免疫荧光染色后的球体形态。观察球体致密程度、轮廓规整度，反映细胞间黏附力与自我组织能力。实验注意事项接种时尽量减少晃动，防止细胞分布不均，出现多个小球粘连融合。换液时枪头远离球体，降低机械扰动。成球周期存在细胞株差异，初次开展实验建议设置时间梯度观察。如果球体容易散掉，可以微调生长因子浓度、降低接种密度。 |
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