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科研战神来了新虫 (小有名气)
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外周血 PBMC 分离 CD8⁺T 细胞实操方案｜纯度 & 活性把控要点
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方案从人外周血提取 PBMC，再通过免疫磁珠阳性分选获得 CD8⁺T 细胞，同步包含 T 细胞激活扩增流程，适配后续流式鉴定与功能实验。一、外周血 PBMC 分离1.样本收集：采用绿色抗凝采血管收集静脉血，单管采血约 2 mL，本次共采集 5 管，合计 10 mL。将血液分装至 15 mL 离心管，加入 PBS 补至 5 mL；单管血液体积大于 2.5 mL 时，按照血液：PBS = 1:1的比例进行稀释。2.铺分离液与加样：准备 10 支空 15 mL 离心管，每管加入5 mL 外周血淋巴细胞分离液。使用 1 mL 枪头贴壁缓慢加入稀释后的血液混合液，初始加样阶段离心管倾斜约 30°，让液体平缓漂浮于分离液上层；后续加样将离心管调整至 60°，全程贴壁、低速加样，避免血液冲破液面混入分离液下层，破坏分层效果。3.密度梯度离心：配平离心管，1000 g，离心 30 min。离心后管内分为四层，由下到上依次为红细胞层、分离液层、PBMC 白膜层、血清层。小心吸取中间白膜层细胞，转移至新离心管，加入 5 mL PBS 混匀，250 g，离心 10 min。4.洗涤细胞：离心结束后弃上清，优先倾倒大部分上清，再用 1 mL 枪头吸走管底残留液体。加入 5 mL PBS 重悬细胞沉淀，合并细胞至 1–2 支 15 mL 离心管，250 g，离心 10 min。5.T 细胞激活铺板：弃上清，使用 T 细胞培养基重悬细胞。细胞数量偏低时，可用 1 mL 培养基合并重悬 2 管细胞；细胞数量充足时，1 mL 培养基重悬单管细胞。将细胞悬液转移至 12 孔板，单例患者的细胞铺 2 个孔。6.配制细胞因子混合液：2 孔总量为100000 单位 IFN-γ 与 IL-2，用 400 μL 培养基混匀，每孔加入 100 μL；按照每 1 mL 细胞培养基添加 25 μL的比例，加入 ImmunoCult™人 CD3/CD28 T 细胞激活剂。放入培养箱进行激活扩增。二、CD8⁺T 细胞磁珠分选提取1.收集激活后的 T 细胞：轻轻吹打孔内细胞，收集全部细胞悬液至 15 mL 离心管，进行细胞计数，300 g，离心 10 min。 2.孵育 CD8 免疫微珠：弃上清，按照每 1×10⁷个细胞用 80 μL autoMACS 冲洗缓冲液的比例重悬细胞。避光条件下，每 80 μL 细胞悬液加入 20 μL CD8 微珠，混匀后置于 4℃环境孵育15 min，孵育时长需要严格把控。 3.洗涤细胞与润洗分离柱：孵育完成后加入 1 mL 缓冲液混匀洗涤，300 g，离心 10 min。离心间隙同步准备分离柱，将分离柱固定于分离器磁场内，使用 500 μL 缓冲液润洗分离柱 2 次；加样时枪头贴近柱内液面低速加入，规避气泡产生。4.上样与洗柱：离心结束弃尽上清，用 500 μL 缓冲液重悬细胞。将细胞混悬液缓慢加入分离柱，等待液体自然流尽；再加入 500 μL 缓冲液冲洗柱子，CD8⁺T 细胞会结合在磁珠上留存于柱内，阴性细胞随液体流出。5.洗脱收集目标细胞：柱内液体完全流空后，取下分离柱，加入 1 mL 缓冲液，使用配套栓塞将柱内结合的 CD8⁺T 细胞推出，用 EP 管收集细胞悬液。收集后300 g，离心 10 min，弃上清，加入 1 mL 培养基重悬，再次计数。6.细胞培养与鉴定：将分选得到的 CD8⁺T 细胞接种至 12 孔板培养，添加 IFN-γ、IL-2 以及 ImmunoCult™人 CD3/CD28 T 细胞激活剂维持活化状态。 取20–30 万个细胞，使用 200 μL 体系重悬，加入多聚甲醛固定1 h，固定结束后更换 200 μL PBS 重悬，用于后续流式检测。实验实操提示密度梯度离心升降速设置为慢升慢降，防止分层被扰动。磁珠孵育全程避光，缓冲液提前预冷。分离柱内一旦产生大量气泡，会降低分选纯度，加样操作尽量平稳。分选后的细胞尽快铺板或者固定送检，减少细胞活力下降。 |
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