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科研战神来了新虫 (小有名气)
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细胞 RNA 提取：12 孔板体系样本处理与质控要点汇总
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一、试剂与耗材准备试剂：预冷试剂包括 4℃离心机、Trizol、异丙醇、75% 乙醇、90% 乙醇和 DEPC 水。常温试剂包括无菌 PBS、氯仿和异丙醇。耗材：无酶 1.5mL 离心管、各种量程枪头。Trizol 和氯仿具有刺激性，操作时佩戴好口罩和手套。所有试剂、枪头和离心管按无 RNA 酶要求处理，避免外源 RNA 酶污染。 二、细胞裂解取出细胞培养板，弃去旧培养基，用无菌 PBS 轻轻清洗细胞 2 次。清洗时沿孔板侧壁缓慢加入 PBS，避免直接冲散细胞层。通风橱中加入 Trizol。12 孔板每孔通常加入 500μL Trizol，1mL 枪头反复吹打孔底，确保细胞充分裂解。细胞量较高时，可适当延长裂解时间至 5–10min。裂解完成后，将每孔裂解液转移至无酶 1.5mL 离心管中。 三、氯仿分层向每管裂解液中加入 100–250μL 氯仿，氯仿用量约为 Trizol 体积的 1/5。盖紧管盖后剧烈振荡 15–30s，使液体充分乳化，室温静置 10–15min。随后 4℃、12000rpm 离心 15min。离心结束后，样本分为三层：上层为无色水相，中间层为白色蛋白层，下层为粉色有机相。小心吸取上层水相，转移至新的无酶 1.5mL 离心管中。吸取量通常为 200–400μL，操作时避开中间白色蛋白层。 四、异丙醇沉淀 RNA向新管中加入等体积预冷异丙醇，轻柔混匀 10 次以上，冰上静置 10min。4℃、12000rpm 离心 30min。长时间离心有助于提高低丰度 RNA 回收率，尤其适合细胞数量较少的样本。离心结束后，管底可见白色或半透明沉淀。 五、乙醇洗涤 RNA小心弃去上清，保留管底沉淀。加入预冷的 75% 乙醇 1mL，轻柔颠倒洗涤离心管管壁。洗涤过程中避免剧烈吹打，防止沉淀破碎丢失。4℃、12000rpm 离心 10min，弃去上清。沉淀较大时，可再用 90% 乙醇重复洗涤 1 次，进一步减少杂质和盐类残留。每次洗涤后离心，都要注意离心管摆放方向。沉淀通常集中在离心管底部外侧，弃上清时不要吸到沉淀。 六、干燥与溶解 RNA最后一次离心结束后，用枪头吸走大部分上清，保留沉淀。打开管盖，在通风橱中干燥 5–10min。干燥时间不宜过长，否则 RNA 沉淀会变难溶。根据细胞量和沉淀大小加入 DEPC 水。细胞量较少时加入 10–15μL，沉淀较大或浓度较高时可适当增加至 20–30μL。先对沉淀区域轻柔吹打，再沿管壁反复吹打 50–100 次，帮助 RNA 充分溶解。溶解后短暂离心，将液体收集至管底。 七、RNA 浓度与纯度检测检测前用 DEPC 水清洗检测平台，并用 DEPC 水调零。按顺序加入 RNA 样品，建议每个样品检测 1.5–2μL。浓度结果与铺板密度、细胞状态、裂解效率和洗脱体积有关。12 孔板 60% 密度、约 6×10^5 细胞量时，沉淀通常较明显，浓度和纯度可满足后续实验要求。判断纯度主要看两个比值：A260/A280＞1.8，提示蛋白污染较少；A260/A230＞2.0，提示有机溶剂和盐类残留较少。 实操注意事项提取过程中保持动作温和，尤其在乙醇洗涤和弃上清阶段。每一步都要区分细胞裂解液、上清和沉淀位置，避免误吸丢失。RNA 样本建议立即用于反转录，或分装后置于 - 80℃长期保存。 |
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