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科研战神来了新虫 (小有名气)
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细胞 ROS 荧光检测：探针选型、孵育条件与结果质控要点
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| 做细胞氧化损伤实验，不知道怎么检测活性氧？整理了实验室使用频率较高的两种荧光探针检测方法，从原理到操作步骤一次性整理，新手可以直接参照开展！先搞懂：两种探针原理怎么区分？ 两款探针都用于 ROS 检测，但检测靶点与成像效果存在区别，实验选择时不要混淆。 DHE（二氢乙锭） 探针本身可以穿透细胞膜进入胞内，接触 ROS 后发生脱氢反应生成溴化乙锭。溴化乙锭与细胞内核酸结合，释放红色荧光。荧光强度和 ROS 含量呈正相关，ROS 积累越多，红色荧光信号越强。该探针多用于胞内超氧阴离子检测，也可用于细胞整体 ROS 水平评估。DCFH-DA 探针本身无荧光信号，进入细胞后会被酯酶水解，转化为无法穿出细胞膜的 DCFH。DCFH 遇到 ROS 会被氧化，生成带有绿色荧光的 DCF，荧光强度随 ROS 水平升高而上升，是 ROS 检测中使用广泛的探针。提前准备：参照产品说明书配制探针浓缩母液，分装保存，减少反复冻融对探针活性造成的损耗。本实验室常用方案：DHE 用于 Caco-2 细胞 ROS 检测，DCFH-DA 用于 HT29 细胞检测。大家可以根据自身实验模型，挑选适配的探针。实验操作流程①.细胞处理：按照实验设计完成细胞造模与给药处理。处理结束后吸除 24 孔板内原有培养基，使用常温预热的 PBS 轻柔清洗细胞，一共洗涤 3 次，单次洗涤时长 3 分钟。操作动作保持轻柔，避免吹落细胞。②.探针避光孵育：每孔加入 1mL 按 1:1000 比例稀释配制的荧光探针工作液。用锡箔纸包裹培养板，放置细胞培养箱避光孵育 20 min。荧光探针遇光会发生淬灭，配液和孵育全程做好避光防护。③.细胞核染色：探针孵育完成后，吸除孔内染料。每孔添加 200 μL DAPI 工作液，室温孵育 10 min 标记细胞核。④.样本清洗：使用预热 PBS 再次清洗细胞 3 次，每次 3 min，洗脱游离未结合的染料，降低成像背景荧光。⑤.荧光成像采集：放置荧光显微镜进行观察，切换对应通道采集图片。DHE 选择红色荧光通道，DCFH-DA 选择绿色荧光通道，DAPI 通道采集细胞核信号。⑥.数据分析：使用 ImageJ 软件分析图像，读取各组平均荧光强度，对比不同处理组之间 ROS 水平的差异。⑦.实验设计层面，需要设置至少 3 次独立重复实验，每组处理设置 3 个复孔，降低实验误差，让统计结果更稳定。最容易踩的坑忽略避光操作:荧光探针见光易淬灭，探针配制、样本孵育环节都需要避光，荧光信号会变弱，造成检测结果偏差。洗涤不充分:残留游离染料会拉高背景荧光，需要保证洗涤次数与洗涤时长。孵育时长把控不当:20 min 为常规孵育时长，孵育时间不足，探针反应不充分；孵育过久，会增加非特异性结合，图像背景杂乱。探针稀释比例不合适:探针浓度过高，背景荧光偏高；浓度过低，目标信号偏弱，1:1000 是常规推荐稀释比例。两种探针均为成熟的 ROS 检测手段:如果需要配套 WB 验证细胞氧化损伤表型，可以同步补充 MDA、SOD 指标检测，丰富实验数据。 |
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