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科研战神来了新虫 (小有名气)
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[交流]
中性粒细胞提取耗时长、活性差？这套快速分离方案亲测有效
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小鼠骨髓来源中性粒细胞是免疫、炎症相关体外实验常用的原代细胞。密度梯度离心法借助 Percoll 分层液，可从骨髓细胞悬液中分离获得高纯度中性粒细胞。操作全程需要维持无菌低温环境，分层液界面的完整度，会直接影响细胞收获数量与纯度。下面这套流程，整理了骨髓收集、Percoll 密度梯度分离、红细胞裂解完整操作步骤。 一、骨髓细胞收集选取 2～3 只小鼠，采用颈椎脱臼法处死，将小鼠整体置于 75% 乙醇中浸泡 5～10 min 进行体表消毒。在无菌操作环境下，解剖分离胫骨与股骨，剥离附着的肌肉组织，立即放入添加双抗的预冷 PBS 中暂存。用剪刀剪去骨骼两端骨骺，暴露骨髓腔。抽取含 10% FBS、2 mM EDTA 的 RPMI 1640 培养基，从骨骼一端缓慢冲洗骨髓，冲洗液经过 70 μm（200 目）细胞筛过滤，收集到 15 mL 离心管内。反复冲洗骨髓腔，直到骨骼外观发白，无红色骨髓残留。收集好的骨髓细胞悬液，4℃条件下 500 g 离心 5 min。离心结束弃去上清液，加入 1.5 mL 预冷 PBS 重悬细胞沉淀，得到 1.5 mL 骨髓细胞悬浮液备用。 二、Percoll 密度梯度分离提前准备塑料离心管，使用 FBS 润洗管壁，减少细胞贴壁损耗。使用 1 mL 注射器沿离心管壁缓慢铺加分层液，操作动作轻柔，防止不同浓度液体发生混合。先加入 2 mL 80% Percoll 溶液，再沿管壁缓慢叠加 2 mL 65% Percoll，最后缓慢加入 2 mL 55% Percoll。分层液全部铺完后，室温静置 5 min，让各液体层界面稳定。将制备好的骨髓细胞悬浮液，沿着管壁缓慢加到分层体系的最上层。设置水平转子离心机，升速 1，降速 1，室温 1200 g 离心 30 min。离心完成后管内会形成清晰的分层，中性粒细胞富集在 80% 与 65% Percoll 之间的白色条带位置。使用移液管小心吸取上层液体弃除，再缓慢收集 80%-65% 界面处的白色细胞条带，转移至新离心管。 三、红细胞裂解与细胞清洗收集到的中性粒细胞组分中，会混有少量红细胞，加入红细胞裂解液处理。裂解完成后补加足量 PBS 终止裂解反应，4℃ 500 g 离心 5 min 弃上清。使用预冷 PBS 或者完全培养基重悬沉淀，重复洗涤 1～2 次，去除残留的裂解液与 Percoll 残留，即可用于后续细胞实验。 四、注意事项Percoll 梯度铺层全程动作平缓，液体界面一旦混匀，会大幅降低中性粒细胞分离纯度。离心必须选用水平转子，升降速调低，刹车过快会破坏已经形成的密度分层。骨骼剥离、冲洗、细胞收集环节尽量在冰上操作，降低中性粒细胞体外活化。分离后的中性粒细胞活性衰减较快，建议获取细胞后尽快开展后续实验。 |
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