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科研战神来了新虫 (小有名气)
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原代神经元培养屡养屡崩？这套完整方案帮你稳住细胞状态
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一、准备工作灭菌耗材与试剂准备 高温灭菌显微器械，2 套外科剪 + 镊子，1 盒 1000μl 蓝枪头、1 盒 200μl 黄枪头，准备无菌双蒸水。 培养板包被处理 配制 poly-L - 赖氨酸溶液，溶于灭菌双蒸水后滤器过滤除菌。 6 孔板每孔加入 1000μl poly-L 溶液； 12 孔板、24 孔板提前放入圆形盖玻片，每孔加入 500μl poly-L 溶液，放置细胞培养箱过夜。 次日吸走 poly-L 溶液（可回收留存），灭菌双蒸水清洗孔板 3 次，置于超净台晾干备用。神经元完全培养液配制 500ml Neurobasal（NB）基础培养基，添加配套 B27 添加剂、5ml L - 谷氨酰胺、5ml 青链霉素双抗，混匀后 4℃避光保存。 二、原代神经元提取分离 胎鼠取材 选取孕 18d 左右孕鼠，断颈处死，75% 医用酒精浸泡全身 3~5min 体表消毒。第一套外科剪镊剪开腹部皮肤，更换第二套无菌剪镊剖开腹腔，取出含胎鼠的子宫，转移至预冷无菌 PBS 中。剪开子宫，取出胎鼠，快速断头，分离胎鼠完整脑组织。 脑膜剥离 全程低温，体视显微镜下使用灭菌显微器械打开颅骨，取出完整大脑，剥离脑组织外层硬脑膜、蛛网膜以及附着血管组织。 脑膜、血管残留会引入杂细胞，造成污染。 脑组织清洗 将剥离完成的胎鼠大脑实质放入盛有预冷无菌 PBS 的培养皿，漂洗 2~3 次，去除残留血液。 组织消化 吸净 PBS，加入 5ml 0.25% 胰蛋白酶，37℃培养箱消化 5min；也可选用木瓜蛋白酶 + DNA 酶组合，37℃消化 20min。消化期间轻晃培养皿，使酶液浸润全部组织块，观察组织松散状态，防止过度消化损伤神经元。 终止消化 吸除胰酶消化液，加入预冷无菌 PBS 5ml，漂洗组织 2~3 次，终止酶解反应。吹打过滤制备细胞悬液 加入 10ml 无菌 PBS，移液枪缓慢适度吹打脑组织，打散组织团块制备细胞悬液。 悬液经一次性细胞筛过滤收集滤液；沉淀可再次加入 PBS，重复吹打、过滤 2~3 次，充分回收细胞。细胞离心收集 收集的细胞悬液，1200rpm 离心 10min，弃上清，保留管底细胞沉淀。细胞重悬与计数 向细胞沉淀加入约 10ml （Neurobasal）NB 完全培养基，缓慢吹打分散细胞团，制备单细胞悬液。擦拭干净血细胞计数板与盖玻片，盖上盖玻片，吸取 10μl 细胞悬液滴加在盖玻片边缘，依靠虹吸填满计数区域，静置 3min。操作避免气泡，悬液不可流入计数板侧边槽。 计数规则：记上不记下，记左不计右；重叠细胞计 1 个，压线细胞只统计左侧与上方。 计算公式：细胞数 /ml = 四大方格细胞总数 ×10000。 细胞接种 按照对应密度接种至提前包被好的培养器皿： 6 孔板接种密度约 1×10⁶个 /ml； 12 孔板接种密度约 2×10⁵个 /ml； 培养皿接种密度约 1×10⁷个 /ml。 接种后轻晃培养板，使细胞均匀分布，放入 37℃、5% CO₂细胞培养箱静置培养。 三、培养与日常观察 形态观察 显微镜定期观察神经元生长状态，查看胞体饱满程度，以及轴突、树突的延伸生长情况。 换液操作 培养期间每 2 天进行一次半量换液。根据神经元存活、老化状态调整，镜下观察到大量神经元凋亡老化时，缩短换液间隔。换液动作轻柔，不要直接冲击贴壁神经元。 污染监控 每次镜检同步排查污染，留意细菌、真菌污染迹象。 出现培养液浑浊、菌丝、大量游动小点时，及时处理。 四、注意事项 取材、消化、接种全程严格无菌操作，器械提前灭菌，在超净台内完成操作。 优先选用胎鼠脑组织取材，胎鼠神经元活力更高，更易贴壁、长出突起。 培养板、培养皿必须提前用 poly-L 赖氨酸包被，保证神经元正常贴壁。 剥离脑组织时，脑膜与血管清理干净，减少成纤维细胞、血管内皮等杂细胞污染。 吹打细胞动作轻柔，强力吹打会造成神经元破碎死亡； 严格控制消化时长，避免消化过度。 全程尽量低温操作，取材过程快速完成，缩短脑组织离体时间，降低神经元损伤。 |
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