| 查看: 31 | 回复: 0 | |||
科研战神来了新虫 (小有名气)
|
[交流]
蛋白变性一律 100℃煮 10 min？WB 条带差或许问题就在这
|
|
WB 实验翻车，十次里有八次问题出在样本处理。同样的蛋白样本，加热温度相差 30℃，最终条带效果天差地别。不同类型蛋白的煮样条件不能一概而论，照搬 100℃沸水 5 分钟的通用操作，很容易出现蛋白聚集、孔道堵样、条带糊团、信号丢失等问题。 1.胞质蛋白（可溶性蛋白）：沸水快煮 5 min代表蛋白：GAPDH、β‑actin、tubulin，绝大多数胞质信号蛋白加热条件：95‑100℃，5 min；样本粘稠、核酸含量高、蛋白浓度高时，延长至 10 min。操作要点：加热结束后立刻置于冰上冷却，短暂离心后再进行上样。 2.膜蛋白（多次跨膜蛋白）：禁止 100℃煮沸代表蛋白：GLUT1、P‑糖蛋白、各类 GPCR、离子通道 多次跨膜蛋白在 100℃煮沸条件下，会发生不可逆蛋白聚集。蛋白抱团沉淀，要么堵在上样孔无法电泳分离，要么条带弥散糊成一团，即便使用高质量抗体也无法获得有效结果。三种可选处理方案，任选其一室温放置 15‑20 min冰上放置 30 min70℃加热 10‑20 min（实验室最常用温和方案）单次跨膜膜蛋白耐受性相对更好，70℃加热 10 min，多数样本可稳定完成变性。3.核蛋白 & 高分子量蛋白（＞150 kD）：70℃低温慢 “炖”核蛋白分子量大，蛋白结构容易互相缠绕，100℃高温煮沸同样会引发蛋白聚集。加热条件：70℃，10 min前置操作：蛋白提取阶段需要冰上全程操作，使用超声破碎帮助核蛋白充分释放。电泳转膜提示：大分子量蛋白转膜不能简化流程，选用湿转，按需延长转膜时间。 4.磷酸化蛋白：高温快煮灭活，仅可加热一次磷酸化检测最大干扰来自样本内磷酸酶，蛋白样本离体之后，磷酸酶就会持续去除蛋白上磷酸基团。裂解环节必须添加磷酸酶抑制剂（NaF、Na₃VO₄）。加入 Loading buffer 后，100℃加热 5 min，高温灭活磷酸酶。样本建议小体积分装冻存，仅允许加热一次；复融样本补煮 5 min，不可反复加热。全程冰上操作；封闭液选用 5% BSA，禁止使用牛奶，牛奶本身含有磷酸酶，会干扰磷酸化信号。 5.WB 煮样通用操作红线（全部蛋白样本均适用）操作顺序固定：蛋白定量 → 添加 Loading buffer → 加热变性。未完成定量直接煮样、不加 Buffer 干煮，样本直接报废。 加热进行到 2‑3 min 时，取出 EP 管弹击管壁，让管内样本受热均匀，规避局部过热。样本总加热时长不要超过 15 min，长时间加热会造成蛋白凝固分层、蛋白降解。 加热后样本如果出现明显絮状沉淀、液固分层，代表蛋白发生不可逆聚集，直接舍弃该管样本。注意：native PAGE 非变性电泳样本，完全不能加热，加热会直接破坏蛋白构象，整板胶实验失效。 6.通俗记忆煮蛋白可以类比煲汤： 胞质蛋白如同火锅，大火快涮 5 分钟； 膜蛋白如同燕窝，温水慢煨，严禁滚沸； 核蛋白如同老火汤，70℃小火慢炖； 磷酸化蛋白如同爆炒，达到规定火候就要结束处理。提取完蛋白之后，先判断目标蛋白类型，再选择对应的加热条件。煮样步骤虽小，却直接决定 WB 条带最终质量。 |
回复此楼» 猜你喜欢
极限拉扯，如何抉择
已经有10人回复
-
入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍
已经有6人回复
-
OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？
已经有8人回复
-
课题组会帮你通过考核么？
已经有6人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有9人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有8人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有10人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有9人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急
已经有7人回复
-
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有10人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
