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乐备实LabEx

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[交流] 单细胞VDJ测序：从B细胞库中精准挖掘抗体药优势克隆

一、抗体发现的瓶颈：为什么需要单细胞VDJ测序
治疗性抗体药物是过去二十年生物医药领域最成功的赛道之一。从最早的鼠源抗体到人鼠嵌合抗体，再到全人源单抗，抗体药物的开发效率一直在提升，但有一个环节始终是瓶颈——如何从免疫动物或康复患者的B细胞库中，快速、准确地找到那几个真正具有成药潜力的抗体克隆。

这个问题的难度在于B细胞库的庞大规模。一只经过免疫的实验动物，脾脏和淋巴结中包含数百万个B细胞，每个B细胞的BCR（B细胞受体）基因序列都是独一无二的V(D)J重组产物。其中真正识别目标抗原的B细胞可能只占万分之一甚至更低的比例。从这个庞大的库中筛选出目标克隆，同时保留轻重链的天然配对信息，是抗体发现工作的核心挑战。

传统的抗体发现路线各有短板。杂交瘤技术需要将B细胞与骨髓瘤细胞融合，再逐株筛选阳性克隆。这个过程周期长达数月，人力消耗大，而且兔和人的杂交瘤融合效率远低于小鼠，大量稀有克隆在融合和有限稀释过程中被丢失。噬菌体展示技术绕过了细胞融合，在体外构建抗体文库进行筛选，但它在体外重新组合重链和轻链——体内天然的配对关系被打破，后续需要大量验证工作来确认哪些组合真正具有高亲和力，假阳性率居高不下。Bulk BCR测序则是把所有B细胞的mRNA混在一起测序，虽然能获得克隆型频率信息，但丢失了单细胞水平的轻重链配对，无法知道哪条重链和哪条轻链来自同一个B细胞。

单细胞VDJ测序技术正是在这一背景下成熟起来的。它的核心价值不在于“测序”本身，而在于在单细胞水平原位捕获B细胞的重链和轻链全长序列，保留天然配对关系，再通过多维生信打分从海量克隆中筛出最有潜力的候选抗体——不是给研究者一堆原始序列让他们自己去挑，而是交付经过排序的、可直接进入重组表达验证的优势克隆列表。

二、单细胞VDJ测序的技术原理与流程
（1）VDJ测序的分子设计
B细胞受体的多样性来自V(D)J基因重组。重链由V、D、J三种基因片段重组而成，轻链（kappa或lambda）由V、J两种片段重组而成。要获得一个可直接用于重组表达的抗体基因，必须拿到从重链V基因起始到J基因结束的全长可变区序列，同时知道对应的轻链序列——而且必须确认这条重链和这条轻链确实来自同一个B细胞。

单细胞VDJ测序利用微流控微孔或油包水微滴技术，将单个B细胞与带条形码的微珠隔离在独立微环境中。细胞裂解后，mRNA被微珠上的引物捕获并反转录。针对BCR可变区的特殊需求，在反转录和扩增环节加入覆盖V基因前端和恒定区后端的特异性引物对，确保扩增出从CDR1到CDR3的完整可变区序列。由于同一个细胞的重链和轻链mRNA都被同一个微珠的条形码标记，在后续生信分析中可以将它们归属于同一个B细胞，实现天然配对。

（2）实验流程
（1）样本制备与抗原富集。从免疫动物（小鼠、大鼠、兔等）的脾脏、淋巴结或外周血中分离淋巴细胞。如果目标是筛选抗原特异性B细胞，可以通过荧光标记抗原进行FACS分选，或通过磁珠偶联抗原进行MACS富集，大幅缩小需要测序的细胞群体。

（2）质检与上机。分离后的淋巴细胞悬液经过活率检测和浓度调整，确保细胞活率和浓度满足微流控上样要求。乐备实的方案兼容1000到60000个细胞的通量范围——微量珍贵样本（如穿刺活检或稀有人群样本）和大批量样本（如多只动物混合或高通量筛选）都能稳定上机。

（3）VL-VH捕获。细胞进入微流控微孔阵列后，每个微孔捕获一个细胞和一个条形码微珠。细胞在微孔内裂解，重链和轻链mRNA同时被捕获。

（4）建库与测序。cDNA经过扩增后构建VDJ测序文库，进行二代高通量测序。

（5）标准分析与生信打分。下机数据经过质控、V(D)J基因注释、克隆聚类后，输出每个B细胞的重链和轻链全长序列、克隆型频率分布、CDR3长度和氨基酸序列。在此基础上，乐备实还叠加了独家的多维克隆综合评价体系——不是简单按克隆频率排序，而是综合考虑克隆扩增程度、体细胞超突变水平、CDR3特征序列、框架区保真度等多个维度，对每个克隆进行打分排序，最终输出TOP优势克隆推荐列表。

（6）交付。研究者拿到的不是一堆FASTA序列文件，而是经过天然配对的VH/VL序列对，加上按成药潜力排序的候选克隆推荐——可以直接挑TOP克隆进入重组表达和功能验证阶段。

三、技术优势与传统路线的对比
（1）天然配对保真
这是单细胞VDJ测序区别于噬菌体展示和Bulk测序的根本优势。在微孔中，同一个B细胞的重链和轻链从一开始就被物理隔离在同一个微环境中，配对关系从实验层面就被锁定，不需要后续的生物信息学算法来“猜”哪条重链配哪条轻链。这种原位捕获的方式，从根本上降低了人工拼接带来的假阳性配对错误。

（2）多维克隆评价：不只是测序，更是筛选
普通单细胞测序服务交付的是原始数据和标准分析报告，研究者拿到后还需要自己花大量时间解读数据、筛选候选克隆。乐备实在标准分析之上叠加的多维克隆综合评价体系，核心解决的就是“从序列到可用候选”这一步的转化效率问题。哪些克隆经过了充分的体细胞超突变、哪些克隆的CDR3具有典型的抗原结合特征、哪些克隆在样本中发生了明显的扩增（提示被抗原选择）——这些维度综合打分后，高潜力克隆被优先推荐，研究者不需要在成千上万条序列中盲目试错。

（3）稀有克隆挖掘
在免疫应答过程中，真正高亲和力的B细胞克隆往往是经过多轮体细胞超突变和亲和力成熟筛选后扩增出来的。但在早期免疫阶段或低免疫原性抗原的情况下，优势克隆的频率可能很低——传统杂交瘤筛选在融合和克隆化过程中很容易丢失这些低频但高质量的克隆。单细胞VDJ测序一次可以处理数万个B细胞，即使目标克隆频率在千分之一以下，也有足够的概率被捕获到。这种对稀有克隆的保留能力，对于抗体药物早期发现阶段尤其重要——很多后来成为重磅药物的抗体，在最初的筛选阶段并不是频率最高的克隆。

（4）通量弹性与快速交付
1000到60000个细胞的通量范围，意味着研究者可以根据样本量和研究目标灵活选择。如果只是验证免疫效果、做B细胞库多样性分析，几千个细胞就足够；如果要做大规模抗体筛选、构建AI制药数据集，几万个甚至更多细胞也能承接。从送样到交付结果，约三周即可完成，不需要研究者自行投入微流控设备和测序平台的硬件成本。

四、应用领域与研究价值
（1）治疗性抗体早期发现
从免疫动物中快速筛选具有成药潜力的抗体克隆，是治疗性抗体药物研发最前端也是最关键的环节。单细胞VDJ测序配合抗原富集策略，可以在数周内从免疫B细胞库中输出经过多维排序的候选抗体列表，直接进入重组表达和体外功能验证。相比于传统杂交瘤路线数月的周期和噬菌体展示路线大量的验证成本，这种“测序即筛选”的模式显著压缩了抗体早期发现的时间线。

（2）疫苗免疫应答评估
在疫苗研发中，研究者需要理解接种后B细胞库如何响应抗原——哪些V基因家族被招募、CDR3特征如何演化、记忆B细胞和浆细胞的分化路径是什么。单细胞VDJ测序可以在单细胞水平追踪克隆扩增和体细胞超突变的动态过程，为疫苗免疫原性评价和疫苗优化提供深度数据。

（3）感染免疫与广谱中和抗体筛选
从新冠病毒、HIV等病毒的康复患者或免疫动物的B细胞库中筛选广谱中和抗体，是当前传染病研究的重要方向。单细胞VDJ测序能够从患者外周血PBMC中捕获抗原特异性B细胞，解析其BCR序列特征，为广谱中和抗体的快速发现提供序列基础。同时，兼容PBMC样本的特点使得临床转化研究更加便利。

（4）AI制药数据集构建
AI辅助抗体设计正在成为新药研发的新范式。训练高质量的抗体语言模型和亲和力预测模型，需要大规模、经过实验验证的天然抗体序列数据集。单细胞VDJ测序一次产出数万个天然配对的VH/VL序列对，且覆盖不同物种、不同免疫状态下的B细胞库特征，是构建AI制药训练数据集的重要来源。

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