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做罗伊氏乳杆菌的看过来，差点被它整崩溃
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微生物的遗传操作ZTM不是一般人玩的！ 硕士学植保，虽偏微生物，但依植物周期做，也挺长，寻思博士单玩微生物。博士面试，有个老师（现在的博士老板）介绍说做乳酸菌，材料是从婴儿便便里来的一株罗伊氏乳杆菌，有个别的菌都没有的功能基因。乳酸菌近年来火啊，肠道健康、免疫调节、母婴益生菌，各种热点往上靠，我也觉得高大上，更主要纯做微生物了，直接选上了。结果呢？一上手就傻眼了。 这玩意根本没法做遗传操作啊。 我前前后后折腾了快八个月。刚开始还很淡定，觉得不就是电转嘛，硕士期间大肠、芽孢、农杆、青枯，我转得溜溜的。结果连着一个月，平板上什么都没长。无抗对照长得跟地毯似的，转化组干干净净。有些慌了。 接下来就是各种试：换质粒、换电转杯、调整电压从1.0kV到2.5kV排着队试、调整甘氨酸处理时间从15分钟到2小时、换不同的蔗糖浓度、换复苏培养基、买商业化的乳酸菌感受态……你能想到的参数我都试过。最绝望的一次，平板上一共长了4个菌落，我连夜挑出来做PCR，3个假阳性，1个真的。我激动得差点哭出来，赶紧划板传代，第二天就死了。 就这种状态，我持续了小半年。前面花了很多钱，买试剂盒、买各种添加剂、测序验证，加起来两万多吧。组会上老板说不着急，其实一直黑着脸，真是快崩溃了。每天晚上回宿舍躺在床上就想：要不退学算了。 转折点是有一次出去开会，茶歇交流，有个同行偶然说到找外面公司做基因编辑比自己瞎鼓捣划算，推荐了武汉一家公司。反正当时没太在意，因为之前也问过几家公司，随便问简单的专业点的问题，转来转去经手好些人，感觉像N道贩子，接活再推出去，转几手价就上去了。都是骗钱的！ 会后回酒店刷手机，想起他说的那个公司，上他们官网看了一下，感觉里面介绍的东西还真跟我遇到的情况相似，不是真做过的不可能pou得出来。于是打了他们留的技术顾问电话，接电话的人不太一样，她上来没问我预算，也没急着报价，而是管我要了菌株的基因组序列，简单问了想做什么，说评估后回话。 第二天打电话跟我说：你这个菌株分析了已知功能的8个DNA防御系统，不确定哪个主效质粒防御。要么DNA进不去，要么进去就被它识别切掉了。还给我发了相关的文献，说可以参考一下这里的思路。然后问我，要不要委托他们来处理？价格是敲一个基因加回补1.5万左右，遗传操作他们想办法解决。前期只收20%的预付款做探索实验，成了再付剩下的，不成预付款不退但是尾款不付。很坦诚，提醒能帮着试，不能打包票一定成功。 我算了一下，1.5万的20%也就是3000块钱，不及我两个月自己鼓捣花材料费的零头。跟老板一汇报，老板说也不在乎多花这点钱，也冲他们这种实诚的态度。签了。 后面的事情简单说就是：他们大概用了两个多月，把转化做通了。每两周左右一次进展汇报，或PPT或简单wei联，看得出是真在弄。良心讲，如果最终试不出来，3000块铁定不够他们做完预实验，我折腾过，有数。不真弄，单单亏。 我后来问他们怎么搞定的，人家没藏着，说障碍就是一个IV型R-M系统，他们在质粒转化前对DNA做了去修饰处理（别人的商业秘密，就不详细描述了）。其实他们是说得轻巧了，质粒转前我也过过大肠Trans，就不是这种修饰！这玩意还是有门道的。老板很甘心地付了尾款，毫不夸张，催着付的，看得出高兴了。 虽然转化效率稳定在1×103 CFU/μg DNA，不高，但乳酸菌够用了。自己试过做敲除，但效率还是低，能做转化不一定能做好敲除。后续的敲除、插入、启动子替换都找他们做了。现在课题已经做到功能验证了。说真的，想想之前自己瞎折腾那八个月，花了经费，老板明里暗里push，差点把心态搞崩…… 写这个帖子就是想跟做乳酸菌（特别是罗伊氏乳杆菌，想起来都是泪）的兄弟姐们说一声：如果你们也在遗传操作、基因编辑卡了很久，别太死扛。专业的事真得让专业的人来干，有时候花点钱反而是最省钱的。温馨提醒，显问问专业问题，甄别一下是否贩子。 真心感恩，算是给他们做个宣传，武汉摩剪生物，专做微生物基因编辑，官网www.mjbio.com.cn，上面有挺多菌种的案例，可以先去看看有没有你们做的那种菌。祝大家课题进展顺利，早点毕业！ |
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