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定点突变PCR老是突变不出来？
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定点突变 PCR 跑了两轮，板子上菌落不少，挑了十几个克隆送测序，结果一个突变都没有。或者更干脆，DpnI 消化完转化，板子上干干净净。 这两种"突变不出来"看着像一回事，其实原因走的是两条路，先把现象分清楚，后面排查能省一半劲。 先认现象 板子上菌落很多、测序却全是野生型，问题基本不在转化这一步，是突变根本没合成出来，长出来的都是没被 DpnI 切干净的亲本质粒。板子上一个菌都不长，那是模板、DpnI 或者感受态的事。把这两类分开，方向立刻清楚。 比较不同定点诱变方法的转化效率。 a，基于一对互补引物 PCR 的方法的转化结果； b，基于一对部分互补引物 PCR 的方法的转化结果。 c，基于反向引物对的PCR方法转化结果； d，SMLP方法的结果。 DpnI 没切干净，长出来的全是原版 这是"有菌落没突变"的头号原因。QuikChange 这套玩法的核心，是靠 DpnI 把甲基化的亲本模板切掉，只让新合成出来的突变体质粒去转化。模板必须来自 dam+ 菌株，DH5α、TOP10 这类都行。 要是你的质粒是从 JM110、SCS110 这种 dam- 菌株提的，DNA 上没有甲基化位点，DpnI 根本不认，你最后转化的全是野生型，测序当然一个突变都没有。 菌株对了也不代表万事大吉。DpnI 加少了、37℃ 消化不到 1 小时，亲本模板会残留一大票。模板量加得多的时候更要注意，把消化延长到 1.5–2 小时更稳。 一个实用的判断标准：跑个 DpnI 未消化对照，如果消化完转化出来的菌落数跟没消化差不太多，说明切得不干净，问题就在这。 引物设计比循环数更要命 很多人第一反应是循环数不对，但 16 个循环是 QuikChange 的标准值，绝大多数情况下循环数不是主因。真正容易翻车的是引物本身。 试剂盒要求引物 Tm 落在 78–80℃，突变点放在引物正中间，两侧各留 15–20 个和模板完美配对的碱基；引物的 3' 端最关键，最好压几个 G/C 在尾巴上。两条引物还要互为反向互补，这话听着理所当然，但引物合成出错或者设计时没注意，合成出来的产物根本连不成环，自然没有突变。 退火温度也不是照着 Tm 设。试剂盒的常规做法是把退火放在 55℃ 左右，远低于引物 Tm，因为模板就是个闭环质粒，非特异性的问题不大。要是你把退火温度设到接近 Tm，引物结合不上，产物就出不来，后面全白搭。 模板和酶决定底子 模板质粒至少要有 80% 以上是超螺旋。切口多、被 nick 或者线性化的提不出来完整的闭环产物，跑个胶确认一下比例，宁可重新提质粒。 酶按试剂盒走。QuikChange 用的就是 Pfu 这类带 3'→5' 外切酶活性的高保真酶，这是标准配置，别自己换成 Taq 去"怕突变被修掉"，那是外行的误解，换错酶反而帮倒忙。dNTP 和引物也别反复冻融，分装单次用掉。 循环数到底要不要动 一般情况 16 个循环够用，循环数不是瓶颈。真要调，多半是模板大（超过 5 kb）或者 GC 含量高：延伸时间按 1 分钟/kb 算，必要时加 3% DMSO 缓解二级结构，长模板还可以提一点 QuikSolution。 但比起这些，前面那几步错了，循环数怎么调都救不回来。 别让收尾把产物弄丢 还有几个容易忽略的失分项。PCR 产物纯化那一步，对某些大质粒其实是多余的，有人发现跳掉 cleanup 直接转化反而长得好。转化效率也常被低估，尤其大质粒，感受态要用高效率的（10^8 cfu/µg 以上），DpnI 消化产物可以多取一点（3–4 µL）甚至乙醇沉淀后全量转化。板子别只涂一点点，条件允许就全涂上去。 一句话，突变不出来先按"有菌还是无菌"分情况：有菌看 DpnI 和引物，无菌看模板和感受态。把 DpnI 未消化对照、测序验证过的阳性克隆这两道对照跑齐，问题很快现形。 毕合生物提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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