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Co-ip实验“避坑”指南：让蛋白互作研究更优雅
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1. 非特异性结合怎么办？ ① 严格预清洗样本； ② 选择高特异性抗体； ③ 控制抗体用量，在2-5μg/500μl样本为宜。 2. 蛋白互作弱，结果阴性？ ① 一定要选择IP级别抗体； ② 诱饵蛋白或互作蛋白表达量过低时会产生蛋白互作弱，结果阴性，可通过WB检测Input样品确认目的蛋白是否存在；内源性互作选择高表达细胞系或组织； ③ 延长孵育时间（12-16小时），使用新鲜样本，避免反复冻融破坏蛋白复合体。 3. 如何确保结果可信？ 设置对照：Input（验证蛋白表达）、IgG阴性对照（排除抗体非特异结合）、阳性对照（已知互作蛋白对） 4. 轻重链杂带干扰？ ① 尽量使用避开轻重链杂带位置的抗体做WB实验； ② 使用标签抗体磁珠； ③ 使用标记HRP的一抗，直接显色以避开二抗对IP抗体的识别，选用只识别天然构象抗体或仅针对轻链/重链的二抗，减少交叉反应。 |
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