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科研战神来了新虫 (小有名气)
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实验动物知识！心脏灌流什么时候非做不可？
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一、判断是否开展心脏灌流的标准？ 血液中的血红蛋白、红细胞、白细胞，会对后续检测产生多重干扰。血红蛋白在可见光区域吸收能力强，还会自发产生荧光，拉高荧光染色背景；组织内源性过氧化物酶、生物素会带来免疫组化的非特异性着色，产生假阳性结果；血液残留还会增强组织自发荧光。简单总结：对血液残留敏感的实验，强烈建议进行心脏灌流；血液影响较小的实验可以省去这一步骤。 二、哪些情况必须要进行心脏灌流操作？ 第一类是脑组织取材，尤其是后续要开展免疫染色的实验。脑组织血管密度极高，动物死亡之后血脑屏障会快速崩解，红细胞溢出，形成难以消除的背景污染。这里需要区分清楚：灌流主要影响依赖抗体、荧光信号的检测；HE染色、尼氏染色、镀银、髓鞘染色、高尔基染色这类传统组织学染色，血液残留干扰有限，不灌流一般也可以完成观察。 第二类是免疫荧光（IF）与免疫组化（IHC）实验。这类实验需要抗体孵育，血液里面的内源性过氧化物酶、生物素、Fc受体，都会带来非特异性信号。尤其是CD31、Iba1、GFAP这类本身背景就偏高的靶标，如果不做心脏灌流，几乎很难拿到干净可信的染色结果。 第三类是组织透明化实验，包括iDISCO、CLARITY、CUBIC等技术。全器官透明化的前提就是组织内部无血液残留，血红蛋白吸光能力强，会阻碍透明化进程，造成组织透明不均匀、成像出现暗影，破坏三维成像效果。 第四类为活体成像后的取材验证。先完成活体荧光成像，例如荧光素酶报告基因模型，后续取瘤切片验证信号来源。如果不灌流，很难区分荧光信号是来自目的基因在肿瘤组织的表达，还是血管内残留血液带来的干扰，灌流之后的信号定位才具备可靠性。 第五类是原代细胞分离，例如肝细胞、心肌细胞提取。肝脏灌流本身就是原代肝细胞分离的标准两步灌流法流程，此时灌流不只是清洗血液，更是递送消化酶的关键通道，缺少灌流步骤，很难获得高活性的原代细胞。 三、这些实验场景无需心脏灌流 1. 只做Western Blot或者qPCR检测的样本，组织匀浆之后检测蛋白、核酸，少量血液混入在可接受范围，除非目的蛋白丰度极低并且存在交叉反应，否则不需要灌流。 2. 大部分流式细胞术实验也可以省略，单细胞悬液制备过程中，裂红液能够去除红细胞，替代灌流去除血液的作用。 3. 仅做组织冻存，暂时不开展切片实验的样本，也不必灌流；但如果后续计划改为切片实验，建议提前灌流并双份保存样本。灌流固定不会破坏冰冻切片形态，还能提升切片质量，唯一风险是过度固定会降低部分抗原的免疫原性。 四、心脏灌流的原理及操作步骤 心脏灌流是在动物体内构建单向循环通路，灌注液由左心室进入，顺着体循环流动，再从剪开的右心耳流出，将血管内血液冲出，在组织血供停止的瞬间完成组织固定，整套操作耗时仅5~10分钟。 操作流程：剪开右心耳、左心室穿刺、生理盐水灌注冲洗、4%多聚甲醛灌注固定。操作顺序千万不能颠倒，要先剪开右心耳，再进行左心室穿刺。右心耳剪开后，血液和灌注液才有流出通道，此时灌注才能形成单向循环；如果顺序颠倒，灌注液无法流出，血管内部压力升高，极易出现组织灌注不均，固定失败。 判断灌流是否充分，最通用的标志是肝脏由红变白；部分实验方案还会要求肾脏也变白，以此证明全身循环完成灌透，最终判定标准可以依照实验室既定方案调整。  |
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