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andywang6137

木虫 (著名写手)

[交流] 粗酶液的制备和保存，请教高手

需要测定昆虫体内保护酶系（CAT，POD，SOD）。请教几个问题：
（1）匀浆过程中的缓冲液，我来看了文献，国内基本上生理盐水居多，国外文献有磷酸缓冲液的，也有Tris-HCl，该如何选择？
（2）昆虫解剖用的生理盐水浓度为0.65%，匀浆时也用此浓度吗？
（3）重点：A:  粗酶液的保存：制备的粗酶液该如何保存？4度能保存多久？我需要保存3-4天时间。长时间保存，有的说-20，有的说-80。假如放在-20，再拿出来实验，这就是一次冻融，对酶活力测定影响有多大？  B: 甘油的问题： 低温保存，很多说需要加入10-50%甘油。还是假如-20保存，甘油能和水以任意比例互溶。粗酶液加入甘油后，再拿出来解冻测定，其浓度不是要改变吗？因为无论生理盐水，磷酸缓冲液，tris-hcl，里面都有水。  C：保存时的浓度：很多说高浓度保存效果会好一些，我用南京建成的试剂盒，有10%和1%两种浓度。可否直接配制成这两个浓度分装成不同小管，用时直接那对应浓度的就可以了。还是支配制成10%一个浓度？ D：有的说防止蛋白变性还是降解，加入了聚乙烯吡咯酮（这块记得不是很清楚了），粗酶液保存中需要吗？假如需要，加入了它，对以后测定酶活力有没有影响？  
    请高手指点，谢谢！

[ Last edited by andywang6137 on 2009-11-21 at 11:04 ]
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1楼2009-11-21 11:02:04
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wuweibewin

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
andywang6137(金币+5,VIP+0):谢谢回答 11-22 16:29
cat pod  sod 前两天我们做了，但是做的事植物的！用的是磷酸缓冲液研磨的。
我们都基本上是放在冰上现做现用，顶多保存半天。我们也尝试过用-80保存材料后再提取，结果基本一致。而酶液没有保存过。
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wuwei_hello@163.com
2楼2009-11-21 11:28:30
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caozhichao0

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
andywang6137(金币+3,VIP+0):虽然对我的没什么帮助，还是谢谢你 11-22 16:30
1  材料与方法

    1.1  菌种与培养基

  克雷伯杆菌(Klebisella pneumoniae，DSM2026)来源于德国生物技术研究中心；LB培养基、种子液培养基、发酵培养基参见文献。

    1.2  试剂与仪器

    试剂：NAD(Sigma)、甘油、二羟基丙酮、1，3-丙二醇、二硫代苏糖醇(DTT，AR)。

    吸附树脂：SIPI-40(大孔聚烷酯吸附树脂，比表面积520m2/g)，DA201(大孔非极性聚丙烯酸型吸附树脂，比表面积760 m2/g)，以上为上海华震公司产品；XAD-4(非极性聚苯乙烯型吸附树脂，比表面积750m2/g)，XAD-7HP(弱极性大孔聚丙烯酸酯吸附树脂，比表面积500 m2/g)，以上为美国Amberlite产品。

    仪器：5L发酵罐BIOSTAT.B(德国B.Braun)；细胞破碎仪(宁波新芝)；SP-2000型分光光度计(上海光谱)；高效液相色谱Agilent 1100(美国Agilest)；AminexHPX-87H离子交换柱(Bio-Rad)。

    1.3  克雷伯杆菌游离发酵与粗酶液的制备

    -20℃保存在LB培养基中的克雷伯菌体经种子液活化扩大培养后，以体积分数5%接种量接人装有3上发酵培养基的5 L发酵罐中，37 ℃，200 r/min(无通气)，微氧条件下培养20 h。发酵液于6 500 r/min、1℃离心30 min，收集菌体，用50mmol/L，pH=8.4的Tris-HCl缓冲液与50 mmol/L、pH=7.0的磷酸钾缓冲溶液洗涤两次，按2 g湿菌体悬浮于1 mL上述磷酸钾缓冲溶液(含有2 mmol/LDTT，用于保护酶蛋白的二硫键免受超声波的破坏)的比例，制备菌悬液进行无细胞抽提液(粗酶液)的制备：装有10 mL菌悬液的15 mL离心管置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1 cm，超声功率400W，超声频率30kHz，超声3 s，间歇2s，超声破碎时间12 rain，分两次进行，每次6 rain。破碎后的菌悬液13 000 r/min，1℃离心30 min，上清液即为无细胞抽提液。

    1.4.树脂对底产物、酶和辅酶的吸附性能考察

    树脂预处理(树脂在2倍于树脂体积的乙醇中浸泡2 h，充分溶胀后装入交换柱，用乙醇淋洗8 h，然后用蒸馏水反复洗涤至无乙醇气味)后称取一定质量的湿树脂于50 mL的塑料管中，加入一定量的标准底产物(Gly、DHA、1，3-PD)、粗酶液和辅酶，并定容至一定的体积，然后振荡吸附一定时间，取其上清液测定酶蛋白、辅酶与产物的吸附率。

    1.5  辅酶的分离与再应用

    操作过程：(1)反应管中加入0.10 g甘油和10mL粗酶液，用去离子水补充至50 mL，混匀，取样(样品1)；(2)加入0.079 g辅酶NAD启动反应，反应4h，取样(样品2)；(3)加入5 g树脂，振荡吸附12h，过滤树脂得滤液，取样(样品3)；(4)含有酶与再生辅酶NAD的滤液再加入0.108 g底物甘油，用去离子水补充至50 mL，反应4 h，取样(样品4)。以上各样品均检测反应底产物Gly与1，3-PD的量。

    1.6  1，3-PD酶法连续催化反应

    在1.5节操作的基础上，以1 g甘油为底物进行甘油连续转化制备1，3-PD的反应(粗酶液、NAD及反应体积均取相同的比例)，每次反应4h，反应液经树脂吸附后，滤液继续进行反应，同时吸附产物进行洗脱，洗脱后的树脂继续应用于下批次反应，如此连续进行了3批，最后测定残留甘油的含量及各批次收集的产物的总含量，计算1，3-PD实际总产率。

    1.7  分析方法

    酶蛋白含量测定用考马斯亮蓝法。

    辅酶NAD含量测定：根据氧化态辅酶I(NAD)在260 nm处具有最大吸收峰，其吸光度在一定范围内与NAD浓度成正比的原理，用去离子水配制一定浓度的NAD液(pH=7.0)，用分光光度计在260 nm测定其OD值；本文只表征辅酶吸附率，因此用OD值比直接表示即可。

    标准底产物样品(Gly，DHA，1，3-PD，3-HPA)含量测定：用Agilent1100HPLC系统并用外标法计算，色谱条件：色谱柱Aminex HPX-87H离子交换柱，柱温40℃；检测器为光示差检测器，温度为室温；流动相为φ(乙腈)=35%的水溶液，0.005 mol/L的H2SO4，流速0.4mL/min，进样量20μL。发酵液中底产物测定方法同上，样品需经预处理：2 mL样品在13 000r/min，30min离心后取上清液用水膜过滤3次后再进样。

    2  结果与讨论

    2.1  树脂吸附NAD与酶蛋白的性能考察

    取10mLNAD溶液[ρ(NAD)=0.5 g/L]，加入1 g树脂，微振荡1 h进行吸附，取上清液在260 nm处测定其吸附后NAD含量，分别计算辅酶吸附率，如图2A(略)所示；取1 mL的粗酶液(含GDH与PDOR)定容至10mL，加入1 g树脂，微振荡1 h进行吸附，测定吸附前后溶液中酶蛋白含量，分别计算酶蛋白吸附率，如图2B(略)所示。

    应用树脂吸附特性分离酶、辅酶与底产物，要求树脂对酶与辅酶是弱吸附，才有可能保证与底产物分离。实验选取的几种树脂(SIPI-40、DA201、XAD-4、XAD-7HP)对酶与辅酶基本呈弱吸附，其中，树脂SIPI-40对酶与辅酶综合吸附能力最弱，分别为10%与9%。

    2.2  树脂质量对底产物吸附的影响

    在操作环境下，应用树脂分离混合物并要求再生辅酶能循环利用，则要求树脂对产物亲和性要强，而对酶与辅酶尽量不吸附。筛选实验发现，树脂SIPI-40较其他的树脂对底产物的吸附能力强。称取不同质量的棚旨SIPI-40对卢(Gly，3-HPA，DHA，1，3-PD)=1 g/L的底产物进行36h吸附操作，结果如图3(略)所示。

    树脂SIPI-40质量为1.4 g时，对几种底产物基本达到吸附平衡(对产物1，3-PD最大吸附率为30.5%，对DHA最大吸附率为34.5%)。因此，控制分离体系中树脂质量大于每单位产物浓度数值的1.4倍就可达到吸附平衡。

    2.3  吸附时间对底产物吸附的影响

    配制标准底产物3-HPA、Gly、DHA、1，3-PD溶液(最终质量浓度为2g/L，3-HPA无商品试剂，用自制样品代替)，分别加人3 g树脂SIPI-40，经0.5、1、2、4、8、16、24、32 h吸附操作后取样，测定各组分含量，计算各自吸附率，如图4(略)所示。

    可以看出，产物(DHA，1，3-PD)在较短的时间(<2h)里达到平衡，而底物(Gly，3-HPA)吸附平衡时间则较长(>24 h)，因此可控制较短的分离操作时间(2h)，使产物较快达吸附平衡而迅速从反应液中得到富集。

    2.4  吸附树脂在产物分离与辅酶循环利用中的应用

    为了证明树脂吸附分离能实现产物的分离与再生，辅酶NAD的循环再利用，设计了图5(略)所示实验。

    反应管中加入粗酶液与底物甘油(ρ(甘油)=2g/L)后添加NAD[ρ(NAD)=1.58 g/L)]启动反应，反应管微微振荡反应4h；然后在反应液中加入吸附树脂SIPI-40振荡进行产物吸附2h，将树脂混合液过滤得到含酶与再生辅酶NAD的滤液，再加入新鲜树脂反复吸附至产物基本分离完全；收集滤液回加入反应管中进行第二批次的催化反应，余下步骤同前，操作了3批，以验证树脂分离在酶法制备1，3-PD中的应用效果。

    在此过程中进行取样检测，取样点如图5所示，将获得的样品1、2、3、4分别测定底产物Gly与1，3-PD的含量，计算底产物在反应前后质量浓度的变化，由此计算产物的转化率(conversion rate)，计算公式如下：

    1，3-PD产率(%)=[Δρ(1，3-PD)/Δρ(Gly)]×100%

    根据每批次取样点的测量及计算结果，每批次产物1，3-PD的产率如表1所示。

    表1  辅酶循环利用过程中各批次产物的产率

    Table 1  Product yield of glycerol during coenzyme recycling

Batchs
Δρ(gly)/(g/L)
Δρ(1，3-PD)/(g/L)
yield of 1，3-PD/%

1
0.08
0.018
12.5

2
0.068
0.014
20.6

3
0.057
0.011
19.3


    由表1可见，第一批次反应有ρ(Gly)=0.08g/L得到转化，产生ρ(1，3-PD)=0.018 g/L，因此1，3-PD产率为22.5%；经树脂充分吸附产物后分离得到的酶与再生辅酶液回加入反应管中继续进行催化反应，第二批次、第三批次反应后经计算得产物1，3-PD的产率分别为20.6%与19.3%。由表1数据分析可见，每批次反应液经树脂吸附分离后，滤出的酶与辅酶回加入反应管均可进行再催化，说明辅酶NAD得到了再生并可再利用，而每批次的产物产率逐渐减少，是因为酶与辅酶经树脂吸附分离居有所损失。

    2.5  l，3-PD酶法连续反应制备

    反应连续进行了3个批次，共计12h，反应后测定甘油的残留质量浓度为ρ(甘油)=0.21 g/L，(反应液体积为0.5 L)，收集每批次洗脱产物1，3-PD，测其质量浓度为ρ(1，3-PD)：4.77 g/L洗脱体积为0.085 L。根据1，3-PD实际产率公式：

    1，3-PD实际产率(%)={[ρ(1，3-PD)×V洗脱液]/Δρ(Gly)×V反应池]}×100%

    可计算得1，3-PD实际总产率约为45.3%(本体系中每g甘油中还有一部分用于转化为另一重要工业原料DHA，将另文发表)。

    3  结论

    酶法催化转化甘油生产1，3-丙二醇由于避免了碳源代谢生成相应细胞生物量与其他副产物，因此，比微生物发酵法具有更好的生产潜力，但需从反应液中分离富集产物，回收再利用酶与辅酶才能实现反应的连续进行。从几种吸附树脂的吸附实验结果可知，吸附树脂SIPI-40对酶蛋白与辅酶具有较小的吸附率(<10%)，对产物1，3-PD与DHA则有较大的吸附率(>30%)，基本可满足不吸附酶与辅酶，吸附富集产物的操作要求；在批次验证实验中，测得每批次反应中产物1，3-PD的产率均稳定在20%左右(分别为22.5%、20.6%与19.3%)，说明吸附树脂分离产物在1，3-PD酶法反应中有较稳定的使用效果；在1，3-PD的连续催化反应中，经收集测定，产物1，3-PD相对于甘油的实际总产率达45.3%，说明在酶法催化制备1，3-PD中，应用树脂分离产物达到反应的连续进行是可行的。本研究为1，3-PD酶法连续制备工艺的构建提供了技术基础。

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乾坤无极，我意逍遥！
3楼2009-11-21 11:33:14
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andywang6137

木虫 (著名写手)
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4楼2009-12-05 22:38:01
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