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WJG (IF=7.7) 文献解读｜OA:PA=2:1 构建 HepG2 体外高脂肝细胞模型完整实验方案
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最近读了一篇 WJG 关于 MASLD 体外细胞模型构建的文章，把 HepG2 高脂造模条件、分组、检测指标、机制验证全套整理出来，做脂肪性肝病细胞实验的小伙伴可以直接参考。 一、研究背景 代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），核心表现为肝细胞脂质堆积、糖脂代谢紊乱、肝脏炎症。**PPARα**是肝脏脂质代谢关键核受体，调控脂肪酸 β‑氧化、酮体生成，MASLD 患者肝脏 PPARα 表达下调，是重要干预靶点。 本研究对象 LXO（连和消脂膏）源自黄连温胆汤，临床可改善 MASLD 患者肝功能与脂代谢，文章从成分鉴定→网络药理→动物体内→转录组→细胞体外，完整解析其作用机制，细胞部分是重点机制验证环节。 二、整体技术路线 成分鉴定 (UPLC‑Q‑TOF‑MS) →网络药理学靶点预测→高脂饮食 MASLD 小鼠动物实验→肝脏转录组测序锁定 PPARα 通路→HepG2 高脂细胞体外模型验证→PPARα 抑制剂 GW6471 阻断确认机制依赖关系 细胞实验逻辑：正常 HepG2 培养 → OA+PA 游离脂肪酸高脂造模 → LXO 含药血清干预 → 检测脂质表型 + PPARα 通路相关指标 三、HepG2 高脂模型造模条件（重点） 1. 细胞：HepG2 人肝癌细胞 2. 基础培养基：DMEM +10% FBS +1% 双抗（青霉素‑链霉素） 3. 造模 FFA 配比：**油酸 OA: 棕榈酸 PA = 2:1** ✅终浓度：**OA 200 μM + PA 100 μM** 4. 处理时长：加入 FFA + 含药血清后共培养**48 h** 原理：PA 主要诱导脂毒性、细胞损伤、炎症；OA 侧重诱导脂质蓄积；二者联合更接近体内混合脂肪酸暴露，可模拟脂滴堆积、氧化应激、线粒体损伤等表型。 市面上有商品化预混的高脂细胞添加剂，为无菌预制液体，包含棕榈酸钠 + 油酸钠，无需加热助溶、不容易析出，可直接加到完全培养基使用；处理窗口 24‑72 h，可镜下观察细胞状态调整。 四、细胞实验分组设置 - 对照组：正常 HepG2，无 FFA 刺激 - 模型组：PA (100 μM)+OA (200 μM) 高脂刺激 - LXO 含药血清干预组：设置 2.5%、5.0%、10.0% 三个血清浓度，和 FFA 共处理 - PPARα 抑制剂阻断组：GW6471 **10 μM**，与 LXO 含药血清共同给药，用来证明药效依赖 PPARα 通路 - 阳性对照组：PPARα 激动剂非诺贝特 100 μM 五、全套检测指标（表型 + 分子 + 功能） 1）细胞表型 1. 细胞活力：排除药物是通过杀伤细胞造成脂质下降的假象；文中结果：GW6471 不改变 LXO 对细胞活力的影响，降脂效应不是细胞死亡带来的伪结果。 2. 细胞内 TG 定量：生化定量，评价细胞脂质蓄积水平。LXO 可显著降低高脂模型细胞 TG；加入 GW6471 之后，LXO 降 TG 效应被部分逆转。 3. 油红 O 染色 (Oil Red O)：形态学直观观察胞内脂滴，和 TG 定量结果互相印证，比例尺 50 μm。 2）蛋白分子（WB） PPARα、下游脂肪酸氧化关键蛋白：**CPT1A、ACOX1、HMGCS2** - CPT1A：脂肪酸转运进入线粒体，β‑氧化关键 - ACOX1：过氧化物酶体脂肪酸氧化 - HMGCS2：调控肝脏酮体生成 结果：LXO 上调上述蛋白表达；GW6471 抑制 PPARα 后，上调效应被抵消。 3）功能学指标 细胞外 β‑羟基丁酸 BHB：酮体生成功能读数，代表脂肪酸氧化活化水平。LXO 可升高 BHB；GW6471 处理后 BHB 升高被抑制。 六、核心结论（细胞部分证据链） OA200μM+PA100μM（2:1）处理 48 h 成功构建 HepG2 肝细胞脂质蓄积模型。 LXO 含药血清可以减轻肝细胞脂滴与 TG 堆积；机制上激活**PPARα 通路，上调 CPT1A/ACOX1/HMGCS2，促进脂肪酸 β‑氧化与酮体生成**；当使用 GW6471 抑制 PPARα 后，LXO 的降脂、促代谢效应显著减弱，证明 LXO 改善脂质蓄积的作用**部分依赖 PPARα 信号通路**。 整体机制：LXO 激活 PPARα，一方面加速脂肪酸氧化产酮体，降低胞内 TG/NEFA；另一方面抑制 NF‑κB 炎症通路，降低 IL‑1β、IL‑18，缓解肝脏炎症；同时还可调节肠道菌群，多靶点改善 MASLD。 七、实操小提示 1. OA/PA 模型条件：OA200 μM、PA100 μM，48 h，可作为预实验起点，后续根据自己细胞株、试剂做浓度 / 时间梯度优化。 2. GW6471 工作浓度 10 μM；阳性药非诺贝特 100 μM。 3. 评价模型不要只做油红染色，**TG 定量 + 油红染色 + 细胞活力三者必须搭配，排除细胞毒性干扰，数据才可信**。 4. 自配 FFA 的时候棕榈酸很容易析出，需要注意助溶条件；预制好的混合脂肪酸制剂可以规避析出的麻烦。 文献信息 Nie LJ, et al. Lianhe Xiaozhi ointment ameliorates metabolic dysfunction‑associated steatotic liver disease via peroxisome proliferator‑activated receptor alpha pathway activation. *World J Gastroenterol*. 2026;32(9):114544. IF=7.7 --- 想问下各位虫友，大家做 HepG2 高脂模型的时候，OA/PA 常用什么配比？处理时间一般设置多久？有没有踩过棕榈酸析出、细胞死太多、脂滴造不出来的坑，欢迎一起交流讨论！ |
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