| 查看: 58 | 回复: 0 | |||
科研战神来了新虫 (小有名气)
|
[交流]
转染效率上不去｜细胞质粒、siRNA 转染基础流程！
|
|
最近做了质粒瞬时转染，顺手把完整操作流程整理出来，给刚入门的小伙伴做参考。本次整理以 24 孔板贴壁细胞实验为主，操作简单，适合日常细胞转染实验，实验参数参考试剂说明书整理，本文以 Gencefe 转染试剂为例，其余品牌转染试剂操作逻辑一致，仅试剂添加剂量存在差异。一、转染前准备1. 细胞铺板转染前一天，将贴壁细胞接种至 24 孔板。每孔接种 0.5–2.0×10⁵个细胞，加入 500 μL 完全培养基培养。至转染当日，细胞融合度维持在 50% 左右。 铺板阶段必须使用含血清的完全培养基，避免细胞生长状态变差，甚至出现细胞死亡。2. 实验材料准备提前备好实验耗材与试剂：转染试剂、质粒 DNA、无血清培养基或 Opti-MEM、无菌 EP 管、移液枪及无菌枪头。二、转染复合物配制①24 孔板单孔推荐用量如下：管 A（转染试剂稀释）：无菌 EP 管中加入 50 μL 无血清培养基或 Opti-MEM，再加入 2 μL 转染试剂，轻柔吹打混匀，室温静置 5 min。②管 B（质粒稀释）：另取一支无菌 EP 管，加入 50 μL 无血清培养基或 Opti-MEM，投入 0.5 μg 质粒 DNA，轻柔混匀，室温静置 5 min。③复合物混合：将管 A 液体缓慢滴加至管 B 内，不可反向添加。轻轻混匀后室温静置 15–20 min，等待转染复合物充分形成，配制完成后尽快加入细胞孔。稀释试剂与质粒所用培养基，不能含有血清。三、复合物加至细胞孔将配制完成的 100 μL 转染复合物直接加入对应细胞孔内。加样完成后，轻柔前后左右晃动培养板，让转染复合物在培养基内均匀分布。注意：加复合物这一步，细胞培养基建议更换为无血清无双抗培养基。四、转染后培养与处理将培养板放回细胞培养箱继续培养，转染 6–8 h 后，更换新鲜完全培养基。后续样本检测时间可按下面方案安排：48–72 h：收集样本检测 mRNA 表达水平48–96 h：收集样本检测蛋白表达水平 五、实验实操细节①质粒质量直接影响转染结果 转染效率偏低时，优先排查质粒本身，不要直接判定为转染试剂问题。实验优先选用高质量质粒，质粒 OD260/280＞1.8，尽量选择无内毒素质粒。 ②细胞状态是基础 用于转染的细胞需要形态完好、生长稳定。铺板密度控制在合适区间，细胞不要过密，也不要过于稀疏。状态不佳的细胞，很难获得理想的转染结果。 ③转染试剂与 DNA 比例可优化 说明书给出的数值是初始推荐条件，正式实验中，可结合自身细胞类型微调。可在推荐比例附近设置梯度，测试不同转染试剂 / DNA 配比，提升转染效率。多数细胞体系下，转染试剂与 DNA 适用比例一般不超过 5:1。 ④敏感细胞调整换液时间 部分细胞耐受性弱，长时间接触转染复合物会产生明显细胞毒性。这类细胞可以缩短复合物和细胞的接触时长，提前更换培养基。 |
回复此楼» 猜你喜欢
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有3人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有3人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有3人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急
已经有4人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有3人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有3人回复
-
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有4人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
