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义翘神州

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[交流] 同样的抗体，为什么你的mIHC背景总比文献高？从固定到成像的全套排查手册

拿到一张背景干净、信号清晰、光谱拆分完美的多重免疫荧光（mIHC）切片，是我们美满的理想，现实的残酷却让我们好不容易熬夜拉完的6色panel在荧光显微镜下“显出原形”：荧光通道互相串色、整个切片的背景宛若发光的“夜明珠”、满视野的杂乱的非特异性荧光、低表达的靶点完全被淹没，甚至经历多次抗原修复后，片子直接脱落了。
  mIHC实验步骤繁琐、周期长，一个微小的偏差都可能在后续的实验中被无限放大。样本前处理、多轮“一抗-二抗孵育 tsa信号放大-抗体洗脱（同抗原修复）”重复以及多光谱显微成像，数十个环节，任何一个微小的偏差都可能在终点被无限放大。在本文，我们重点分享样本前期处理可能存在的坑。
细节一：固定不只是泡够时间，而是要控制一段反应历程
  组织固定是免疫组化IHC/mIHC实验的基础，由于mIHC需要经历多次热修复剥离，对固定状态的要求比普通单色IHC要严苛。组织离体后还会在无氧的状态下进行蛋白降解、磷酸化修饰等生理代谢反应。在30分钟内将样本放入10%中性福尔马林中进行固定是一个分界点。ASCO/CAP联合指南对乳腺ER/PR的要求是冷缺血不超过1h、固定6-72h。
  组织离体后没有及时浸入固定液或固定时间太短，可能会导致自溶、核结构模糊、可溶性蛋白迁移或切片完整性差。在经过多次抗原修复后易出现边缘效应和非特异性结合。
  组织在福尔马林浸泡数天甚至数周，可能会造成甲醛与蛋白质交联过度彻底遮蔽抗原表位。后续的抗原修复难以暴露弱表位，导致结果信号弱或无信号，而且还有增加弥漫性背景的可能。
  固定不足或过度都会造成信号弱，我们在进行操作时要严格记录样本离体至浸入固定液的时间、组织块厚度、固定液种类及固定时间和温度。建议大体积样本先切成厚度一致的小块再固定。不要混用固定史不明目的样本。常推荐的固定步骤是离体组织在15分钟内放入10%的中性福尔马林中，室温固定18-24小时，小块样本不应低于12小时。
细节二：石蜡切片要求高
  mIHC需要多轮（3-8轮）抗原修复，切片在液体里反复煮沸，普通载玻片难以承受这种“折腾”，易脱片，建议使用高质量的阳离子防脱玻片或多聚赖氨酸涂层玻片。
省钱小妙招：自制涂层玻片
1. 普通玻片酸洗彻底去除油污，双蒸水冲净，烘干。
2. 用0.01% PLL（多聚赖氨酸）溶液浸泡玻片5-10min。
3. 取出直立沥干，室温自然风干或60℃烘干1h，需要完全干透。
4. 无菌水洗1-2次去除游离PLL，晾干备用。4℃密封保存，6个月内可用。
  除了选对玻片，还有一些操作细节要注意。切片厚度高于6μm会造成核重叠、假共定位和高背景。一般我们在使用带正电荷的防脱切片捞起切片后，会在烤片机上60℃烘烤2-4h或65℃烤1h。为了确定实验过程是否会脱片，可用空白多轮热修复进行验证。在进行实验设计时，建议测试单染条件下各抗体的最佳修复条件。若panel中既有适合pH 6.0的抗体也有适合pH 9.0的抗体，优先选择pH 9.0的修复液（碱性条件下位点暴露效果更好）。为节省时间直接将烧杯放入冷水或冰水浴中，会导致组织剧烈收缩发生脱片或形变。我们应该在加热结束后，让容器在室温下自然冷却20-30min，降至50℃以下后再用PBS或蒸馏水清洗。
细节三、解决自发荧光，先确认它来自哪里
  自发荧光具有宽光谱特征，可同时进入多个通道，影响共表达结果。为确定自发荧光的来源与其对结果的影响程度，我们应优先建立自荧光光谱库并进行线性拆分。在开始mIHC之前，准备一张来自同组织的切片，在相同固定、脱蜡和修复条件下，不加一抗、二抗、TSA与DAPI，进行空白对照，建立自荧光参考。

  脂褐素多呈黄褐色、核周颗粒状，激发和发射范围很宽，常在多个通道的同一位置同时出现。苏丹黑B（Sudan Black B）或铜盐可降低脂褐素样荧光，比如FFPE呼吸组织用含0.3%苏丹黑B的70%的乙醇溶液室温处理10分钟。但还观察到黑色残留、DAPI复染下降等副作用。对于高自发荧光样本，建议在染色步骤结束、DAPI复染前，用市售的自发荧光淬灭剂处理5-10分钟。
细节四：残蜡与短暂干片，难认的假象
  脱蜡不彻底修复液和抗体难以均匀进入组织，出现斑片状弱信号、边缘与中心不一致。二甲苯老化会造成脱蜡不彻底，要定期更换新鲜的二甲苯。如果切片复水后表面润湿不均、有蜡样反光，可能存在残留，需要重新进行二甲苯脱蜡。
  干片会造成不可逆的高背景。切片在抗原修复后换液间隙短暂暴露，可能会造成蛋白或其他组分的局部浓缩，出现组织边缘亮、颗粒状背景或大面积弥漫信号。实验过程要始终保持切片被液体覆盖，那怕是每轮染色结束后用荧光显微镜确认染色情况也要用TBST覆盖切片。已经明显干片的切片不宜继续下一轮的染色。
细节五：坏死区域的干扰不应忽略
  组织坏死区存在核碎裂、蛋白变性、血液成分滞留、自发荧光强等问题，可能会非特异性吸附抗体或者被判为假阳性细胞。在进行多重免疫组化前，应用同批切片进行HE染色。
  常规免疫细胞组化应排除坏死区域和形态无法判读的过渡区，还要把排除规则写入分析方案。但研究缺氧或坏死周边特征，则不能排除而应设置为独立的ROI（感兴趣区域）进行报告。

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