| 查看: 606 | 回复: 0 | |||
[交流]
转染后到底要不要换液？
|
|
转染做完放回培养箱，第二天早上打开培养箱的第一件事是什么。换液还是不换，问三个人你可能得到三个答案：师兄说不换没事，师姐说必须换不然毒死，实验室墙上的 SOP 写着"4-6 小时后更换"。 说明书其实写得很含糊 先看厂商到底怎么说。 Thermo 的 Lipofectamine 2000 质粒转染方案原文是"在进行转基因表达检测前，在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 18-48 小时，培养基可在 4-6 小时后更换"。 Lipofectamine 2000 CD 的版本是"无需更改培养基，但可能需要在 4-6 小时后替换培养基"。而 siRNA 与质粒共转染那份方案说得最明白，原话是无需去除复合物或更换培养基，不过在 4-6 小时后更换生长培养基也行，而且不会减少转染活性。 翻译成人话就是：换不换都行，厂商不强制，换也不会把你的转染搞砸。那实验室里到底在吵什么。 换不换，背后是两股力量在拉扯 吵的不是"能不能换"，而是"该不该换"，背后是两股力量在拉扯。 一边是残留复合物的毒性。脂质体试剂对细胞是有刺激的，尤其用量偏大或者细胞本身就娇气的时候，泡久了细胞状态会掉，状态一掉，你后面测出来的表达量、细胞活力、凋亡指标全跟着歪。 原代细胞、HUVEC、神经元这类难伺候的，反应尤其明显，这也是很多实验室坚持 4-6 小时换液的理由。 另一边是换液这个动作本身的代价。转染复合物被细胞摄取是个持续过程，加进去几个小时里细胞还在不断地内吞，你在这个时间点把含复合物的上清吸掉，等于把还没来得及进细胞的复合物一起倒了。 更麻烦的是机械扰动，刚转染完的细胞贴壁往往不那么牢，吸液加液稍猛一点就能冲掉一片，你最后测到的"效率低"，可能只是细胞少了。 娇气的换，皮实的不换 所以答案取决于你的细胞是哪一类。 293T、HeLa 这类皮实的细胞系，多数情况可以不换，一路培养到收样，少一次操作少一次风险。原代细胞、HUVEC、神经元这类娇气的，4-6 小时换一次更稳妥，别拿细胞状态去赌试剂毒性。 试剂这边同理，低毒的新配方可以不换，老配方或者你为了效率把用量往上加的时候，建议换。 真要换，有个细节比"换不换"更值得注意：别在 4-6 小时这个点全量猛换。Lipofectamine 3000 的实操建议里专门提了一个"梯度换液"的做法，先加一半体积的新鲜完全培养基，静置一小时，再把剩下的一半补进去。 这么做的好处是让试剂毒性缓慢降下来，同时给细胞留够时间完成复合物的后续摄取，避免敏感细胞因为环境骤变导致效率下降。这个思路对 2000 也一样适用。 几个比"换不换"更影响结果的细节 换液的操作本身也有讲究。培养基提前预热到 37℃，沿着孔壁缓慢加进去，别对着细胞层吹打，吸旧培养基的时候枪头别刮到贴壁的细胞。 换完放回培养箱，后面按节奏收样就行：过表达看 24-48 小时，siRNA 敲低通常得等到 48 小时，因为 mRNA 降解本身需要时间，收早了看不到效果。 毕合生物提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
回复此楼» 猜你喜欢
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有6人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有5人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有6人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有4人回复
-
售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有6人回复
-
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有5人回复
-
课题组会帮你通过考核么？
已经有4人回复
-
各位大佬，路线设计求助
已经有8人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
