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研究蛋白磷酸化，为什么要把蛋白送进细胞？
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研究一个蛋白的功能，研究人员经常会先通过过表达、位点突变等方式干预，再检测下游指标变化来实现。但问题细化到某个位点的磷酸化作用时，研究人员就需要分清，观察到的变化是与蛋白数量有关，还是与它的修饰状态有关。 对于这类研究，先制备修饰状态明确的蛋白，再借助蛋白转染试剂进行胞内递送，是一个可行的实验方案。 区分表达量与磷酸化的影响 磷酸化可能改变蛋白的活性及其与其他分子的结合能力。例如，酶的磷酸化可能影响它对底物的作用，转录因子的磷酸化则可能影响其与DNA的结合，进而改变基因表达。因此，研究某个位点的磷酸化作用，有助于理解蛋白的功能如何受到调节，以及这种调节会给细胞带来什么变化。 要回答这些问题，需要将磷酸化检测与功能实验联系起来。但磷酸化信号和下游功能同时发生变化的话，是不足以证明前者导致了后者的。尤其当目标蛋白总量也发生变化时，蛋白数量与修饰状态的影响也可能会混在其中。 例如，目标蛋白总量升高时，即使某个位点的磷酸化比例不变，携带这一修饰的蛋白也会增多。此时，增强的磷酸化信号中就包含了蛋白数量增加的影响。因此，需要结合目标蛋白总量分析磷酸化变化，再通过进一步的功能比较，判断该位点的修饰是否改变了蛋白的作用。 一个不错的思路就是直接递送修饰蛋白。研究人员可以将预先制备的未修饰蛋白和特定位点磷酸化的蛋白分别送入细胞，结合各组的胞内蛋白水平，观察下游功能差异，从而进一步分析该修饰的作用。 把磷酸化p50送入Jurkat细胞 Chen等在2026年刊登于ChemBioChem的研究中，比较了NF-κB p50亚基的不同磷酸化形式。研究人员先在体外制备并纯化蛋白，再使用蛋白转染试剂，将其递送至活化的Jurkat细胞。 其中一组实验比较第60位、第82位酪氨酸单独磷酸化，以及两个位点同时磷酸化的情况。细胞处理后，研究人员再通过放射性氨基酸标记新合成蛋白，检测下游CD40蛋白的表达。 实验结果显示，与野生型p50相比，两种单个位点磷酸化形式均显著提高了CD40表达，双位点磷酸化形式则未使其增加。我们不难看出，在该实验体系中，p50对CD40表达的影响随磷酸化位点组合而变化，但增加磷酸化位点并未带来更强的调控效果。通过蛋白转染，研究人员能够将预先制备的不同修饰形式蛋白送入细胞，分析这些修饰对蛋白作用的影响。 蛋白转染实验的要点 把这种方法用于自己的实验时，需要先确定功能检测指标。比如，研究转录调控，可以检测下游基因或蛋白表达；研究酶的作用，可以观察底物转化或相关活性变化。检测应围绕目标蛋白的具体作用来展开。 胞内定位同样重要。经内吞进入细胞的蛋白，如果仍被限制在囊泡中，就可能无法接触胞质或细胞核内的作用对象。因此，细胞出现荧光信号后，还需要进一步判断蛋白的分布及功能，不能仅凭荧光强弱评价递送是否成功。 实验条件也需要随蛋白和细胞调整。蛋白用量和试剂用量需要组合评估而不是单一考量。出现细胞毒性时，应考虑减少用量或缩短处理时间。不同蛋白转染试剂应以各自说明书为起点，不能直接照搬同一套条件。 在比较修饰蛋白时，还应设置相应的未修饰蛋白和试剂对照，并同时检查细胞状态。递送前明确的修饰状态，在进入细胞后仍可能发生改变，检测时间也需要结合蛋白及修饰的稳定性而定。 针对这些外源蛋白的胞内递送研究，达远辰光提供LL TransR Protein蛋白质递送试剂。如需开展相关实验，可结合目标蛋白、细胞模型及功能检测需求，咨询本产品的适用范围与使用条件。 参考文献 [1] Siddika T, Shao R, Heinemann IU, O'Donoghue P. Delivery of AKT1 phospho-forms to human cells reveals differential substrate selectivity. IUBMB Life. 2024, 76(9), 632-646. DOI 10.1002/iub.2826. [2] Chen S, Potuganti GR, Ji X, Hecht SM. Alteration of CD40 Protein Expression by Tyrosine Phosphorylation of the NF-κB p50 Subunit. ChemBioChem. 2026, 27(1), e202500710. DOI 10.1002/cbic.202500710. [3] Weill CO, Biri S, Adib A, Erbacher P. A practical approach for intracellular protein delivery. Cytotechnology. 2008, 56(1), 41-48. DOI 10.1007/s10616-007-9102-3. |
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