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义翘神州TR-FRET激酶检测试剂盒助力高通量药物筛选
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如何从海量的药物序列或结构中快速找出有潜力的候选物，是创新药开发面临的挑战之一。高通量药物筛选技术（High Throughput Screening, HTS）以分子和细胞水平的实验方法为基础，通过自动化设备和生物化学检测方法，在短时间内筛选数以千计、万计的样品，有助于提高研发效率。该技术可分为荧光分析法、放射性法、化学发光法等，其中荧光分析法价格相对便宜、无放射性标记、安全性好。 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术是一种高通量、稳定且高效的HTS技术，已广泛用于激酶抑制剂筛选、蛋白互作研究及抗体开发领域。义翘神州开发了一系列即用型TR-FRET激酶检测试剂盒，具有简单快速、特异性高、灵敏度高、重复性好等优势，可用于多种激酶检测，支持研究人员快速、稳定地开展高通量药物筛选工作。 一、TR-FRET的优势 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）属于荧光检测技术，结合了时间分辨荧光（TRF）与荧光共振能量转移（FRET）。其原理是供体和受体荧光分子在空间上足够接近（通常在10纳米内），且供体的发射光谱与受体的吸收光谱间存在充分重叠。当供体被脉冲光源激发后，若目标分子发生结合，供体将能量转移给受体，产生665nm的受体荧光信号。通过微孔读板仪在激发一段时间后，分别采集620 nm（供体）和665 nm（受体）处的荧光信号，其比值（665nm/620nm）可定量反应分子的结合程度。 TR-FRET的供体通常为镧系元素：铕（Eu）或铽（Tb），它们以螯合物或穴状化合物的形式存在，具有较长的荧光寿命（毫秒级），可有效消除短寿命的背景干扰。在光谱上，受体染料必须与供体匹配，常用的受体是发红光的染料，如XL665、别藻蓝蛋白（APC）、CyDye™、Alexa Fluor 647 和 d2。铽（Tb）有多个发射峰，也可与绿色荧光受体配对，如绿色荧光蛋白GFP。 TR-FRET通过延迟检测长寿命的荧光信号，降低了背景干扰和信噪比，适用于高通量筛选。其均相“免洗”模式无需多次孵育和洗涤步骤，大幅简化了实验流程，缩短检测时间及样本和试剂的使用量。 我们从检测模式、灵敏度、背景信号、通量等维度，对TR-FRET、ELISA、MSD电化学发光技术、AlphaLISA均相发光分析进行了对比，详见下表。 二、TR-FRET的应用案例 TR-FRET因操作简便及通量高，广泛应用于小分子抑制剂筛选、激酶活性检测、蛋白相互作用、抗体筛选等多种研究场景。 单克隆抗体药物开发高度依赖于抗体-抗原的结合特性的快速、准确评估，如亲和力、表位特异性、竞争关系等。TR-FRET具有均相、免洗、高灵敏度优势，正在成为抗体筛选与功能验证的高通量技术平台。Greenway等人建立了基于竞争TR-FRET的抗体筛选方法：供体是Tb标记的抗体，受体是AF488标记的Fab片段，两者靠近时形成稳定的FRET信号。当体系中加入待测抗体并竞争结合抗原时，FRET信号随之下降，从而定量评估抗体结合能力与亲和力。 小分子抑制剂是靶向治疗和癌症药物开发的重要组成部分。Aromokeye等人成功建立了以TR-FRET为基础的高通量筛选体系，用于鉴定抑制粘着斑激酶（FAK）和黏着斑衔接蛋白Paxillin之间相互作用的小分子化合物。该研究以Tb标记的抗体识别FAK蛋白的FAT结构域，并以biotin-PEG-1907肽模拟Paxillin，通过SA-XL665桥接产生FRET信号。当竞争性小分子结合FAT结构域并抑制其与肽段互作时，FRET信号相应减弱。该体系经优化后适用于384孔板筛选，表现出良好的稳定性和可靠性。研究人员对31,636个化合物进行了初筛，获得240个hits，随后通过反筛（counterscreen）和SPR等实验进一步验证，发现4个小分子可有效抑制FAK与Paxillin的相互作用。 TR-FRET通过夹心免疫法用于激酶活性检测，主要包括两个操作步骤：首先激酶在ATP存在下对特异性底物进行磷酸化，随后加入含有EDTA（用于终止反应）的检测混合液。当供体和受体分别结合到磷酸化底物及其末端的生物素上时，两者被拉近至足够近的距离，从而在激发后发生荧光共振能量转移，产生TR-FRET信号。TR-FRET适合高通量药物筛选（HTS），是开展大规模激酶抑制剂发现项目的理想平台。 义翘神州提供多种用于激酶检测的TR-FRET试剂盒，覆盖酪氨酸激酶（TKs）、丝氨酸/苏氨酸激酶（STKs）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）等多个激酶家族。这些试剂盒具有操作简单快速、特异性高、灵敏度好及重复性强的特点，支持研究人员快速、稳定地开展高通量药物筛选工作。此外，我们还提供高活性高纯度的重组激酶及其他必要的工具，以支持您的激酶研究工作。   |
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